PLCE1在食管鳞癌组织中的表达及其对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响研究

摘要

目的：探讨PLCE1在食管鳞癌、癌旁正常组织中的表达及临床意义；下调PLCE1基因对食管鳞癌细胞增殖和侵袭调控的影响。
　　方法：收集100例汉族食管鳞癌组织及与其对应的99例癌旁正常组织，应用免疫组化Envision法检测PLCE1蛋白表达，并分析其与食管鳞癌临床病理参数及与食管鳞癌患者预后的关系；用PLCE1特异性的siRNA转染食管鳞癌细胞系Eca109、EC9706，应用qRT-PCR、Westem blot及免疫荧光检测siRNA对食管鳞癌细胞PLCE1的干扰效率；转染48小时后，MTT法和单克隆形成实验检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力；Westem blot检测与凋亡相关蛋白及上皮间叶转化相关标记物的蛋白表达情况。
　　结果：（1）PLCE1蛋白在食管鳞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，并且发现 PLCE1高表达与临床TNM分期及淋巴结的转移有关，且PLCE1高表达组比低表达组预后差。（2）选择转染效率高的2条PLCE1-siRNA混合后转染食管鳞癌细胞，qRT-PCR、Westem blot及免疫荧光显示，将这两条siRNA混合后转染食管鳞癌细胞均能抑制PLCE1 mRNA和蛋白的表达量，转染PLCE1-siRNA48小时后，MTT实验结果显示转染的食管鳞癌细胞株与对照组相比，实验组细胞的增殖受到明显抑制，单克隆形成实验显示实验组的细胞团数明显减少，流式细胞术实验显示经过 PLCE1-siRNA转染的食管鳞癌细胞株与对照组相比，早期和晚期凋亡的比率明显升高，利用Westem blot进一步检测凋亡相关分子Bax，BCL-2和cleaved-PARP的蛋白表达情况，结果显示沉默了PLCE1基因的食管鳞癌细胞株中促凋亡蛋白Bax和凋亡标记物cleaved-PARP的蛋白表达量明显增高，而抗凋亡蛋白BCL-2蛋白的表达量明显降低。Transwell实验显示，与对照组相比，转染PLCE1-siRNA的食管鳞癌细胞株的侵袭能力明显降低；Westem blot检测上皮间叶相关标记物，结果发现，PLCE1基因被干扰后，其上皮的标记物E-cadherin明显升高，而间叶的标记物Vimentin则明显下降。
　　结论：（1） PLCE1蛋白在食管鳞癌组织中的表达高于癌旁正常组织，PLCE1蛋白的高表达与食管鳞癌的淋巴结转移和TNM分期有关，且其高表达与食管鳞癌患者预后差密切相关。（2）下调PLCE1基因可抑制食管鳞癌细胞的增殖，促进食管鳞癌细胞的凋亡，提示PLCE1可能参与食管鳞癌细胞的增殖调控；下调PLCE1基因可显著抑制食管鳞癌细胞的侵袭，并且可能通过调控上皮间叶转化来调控食管鳞癌细胞的侵袭转移。

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缩略词一览表

前言

材料与方法

1. 材 料

1.1 研究对象

1.2 主要试剂与耗材

1.3 设计合成siRNA

2. 方法

2.1临床病理学研究内容和方法

2.2 组织芯片制备技术

2.3免疫组织化学方法

2.4 细胞培养

2.5小干扰RNA转染

2.6 实时定量PCR步骤

2.7Western Blot检测

2.8 免疫荧光实验

2.9 MTT测细胞生长曲线

3.0 克隆形成实验

3.1 流式细胞仪检测细胞的凋亡

3.2 Transwell侵袭实验

3.3统计方法

结果

1. 食管鳞癌及癌旁正常组织中 PLCE1 蛋白的表达及与临床病理参数之间的关系

1.1 食管鳞癌及癌旁正常组织中PLCE1蛋白的表达

1.2 PLCE1蛋白表达与食管鳞癌临床病理参数的关系

1.3 PLCE1蛋白的表达与食管鳞癌患者预后的相关性

2 PLCE1特异性siRNA转染食管鳞癌细胞后PLCE1表达下调

2.1四条PLCE1 siRNA转染食管鳞癌细胞后效率的比较

2.2两条PLCE1 siRNA混合转染食管鳞癌细胞对PLCE1蛋白表达的影响

3. 干扰PLCE1表达对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的影响

3.1 MTT实验检测转染PLCE1 siRNA对食管鳞癌细胞增殖的影响

3.2平板克隆形成实验检测PLCE1 siRNA对食管鳞癌细胞增殖的影响

3.3流式细胞术检测PLCE1 siRNA对食管鳞癌细胞凋亡的影响

3.4 PLCE1 siRNA对食管鳞癌细胞凋亡相关分子表达的影响

4. 干扰PLCE1表达对食管鳞癌细胞侵袭的影响

4.1 Transwell检测PLCE1 siRNA对食管鳞癌细胞侵袭的影响

4.2 PLCE1 siRNA对食管鳞癌细胞上皮间叶转化相关标记物表达的影响

讨论

结论

参考文献

文献综述: 磷脂酶Cε1基因与肿瘤关系研究进展

致谢

作 者 简 介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表