细胞融合诱导上皮源性肿瘤发生的实验研究

摘要

目的：细胞融合在肿瘤发生和进展中的作用值得重视，融合可能诱导产生肿瘤干细胞。本研究体外培养人正常胃粘膜上皮细胞系(GES-1)及脐带、脐血来源间充质干细胞(CM-MSCs、CB-MSCs)，探索胃粘膜上皮细胞与CM-MSCs及CB-MSCs融合参与上皮细胞恶性转化的可能，探索肿瘤干细胞的起源。
　　 方法：体外培养GES-1细胞，免疫荧光染色鉴定上皮特异性角蛋白18(CK-18)在GES-1细胞表达情况。脐带及脐血来源间充质干细胞的培养，探索间充质干细胞的培养条件，观察间充质干细胞生长特性。流式细胞分析间充质干细胞表型分子Thy-1(CD90)、SH2(CD105)、SH4(CD73)、HLA-ABC、HLA-DR、CD34、CD45表达。PKH26标记GES-1，CFSE分别标记CM-MSCs及CB-MSCs，50％PEG诱导CM-MSCs及CB-MSCs与GES-1体外融合，流式细胞仪分选双阳性融合细胞。观察融合细胞生长特性，免疫荧光及流式细胞仪鉴定融合细胞CK-18及细胞表面抗原CD90表达情况。划痕实验及transwell检测融合细胞侵袭、迁移能力。融合细胞注射至裸鼠体内验证成瘤能力。
　　 结果：
　　 1.脐血内可获得CB-MSCs，细胞形态第一代时为圆形及梭形，传代后变为纺锤形及多角形，贴壁能力较强，具有很强的自我更新能力，本实验观察其可在体外传至25代。
　　 2.流式细胞技术分析CM-MSCs、CB-MSCs细胞表面免疫表型特征为：SH2(CD105)、SH4(CD73)、HLA-ABC强阳性，CD90弱阳性，、HLA-DR、CD45、CD34阴性，与文献报道相符。
　　 3.细胞经聚乙二醇体外融合可由流式细胞仪分选融合细胞，本实验CM-MSCs与GES-1细胞融合率为3％，CB-MSCs与GES-1细胞融合率为8.7％。分选后融合细胞三天内高表达标记的红荧光及绿荧光，形态不规则，可见巨大融合细胞。两周后细胞开始增殖，增长迅速，可稳定传代。
　　 4.GES-1与CM-MSCs及CB-MSCs的融合细胞胞浆高表达CK-18，融合细胞形态发生改变，细胞核增大，胞浆减少，呈现恶性肿瘤细胞特性。GES-1细胞表面不表达CD90，而CB-MSCs、CM-MSCs及其与GES-1的融合细胞均表达CD90。通过免疫荧光及细胞表面抗原CD90的鉴定证实所分选的细胞为融合细胞。
　　 5.DNA倍体分析结果示融合细胞为多倍体及非整倍体细胞，随细胞代数的增长，非整倍体细胞所占比例增加。
　　 6.CM-MSCs与GES-1的融合细胞增殖活性较CM-MSCs及GES-1明显增强；获得向基质胶侵袭的能力，迁移与侵袭能力增强；融合细胞注射至BaLb/C裸鼠腋下，可在裸鼠皮下形成肿瘤结节，HE染色病理证实为肿瘤组织
　　 结论：MSCs和GES-1在PEG2000刺激下可产生融合细胞。细胞融合后形态发生改变，具有GES-1及MSCs二者的表型。胞浆表达CK-18，表面抗原CD90阳性。融合细胞增殖活性较CM-MSCs及GES-1明显增强，具有向基质胶侵袭的能力，迁移与侵袭能力增强。融合细胞可在裸鼠皮下形成肿瘤结节，表明间充质干细胞和上皮细胞融合可导致上皮细胞的恶性转化。