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肺炎衣原体感染通过促使VE钙粘素磷酸化促进VE钙粘素内吞而增加血管内皮细胞通透性

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声明

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、C.pn 感染增加 VEC 通透性

实验一、免疫荧光染色实验观察 VEC 生长致密时的细胞间连接

实验二、 C.pn 感染对 VEC 通透性的影响

二、C.pn 感染通过促进 VE 钙粘素内吞增加 VEC 通透性

实验一、共聚焦显微镜观察 C.pn 感染对 VE 钙粘素内吞影响

实验二、Western blot 实验观察 C.pn 感染对 VE 钙粘素内吞影响

实验三、C.pn 感染通过促进VE钙粘素内吞增加VEC通透性

三、C.pn 感染通过磷酸化VE促进VE内吞而增加VEC通透性

实验一、C.pn 感染通过促使 VE 钙粘素磷酸化增加 VEC通透性

实验二、C.pn 感染通过促使 VE 钙粘素磷酸化促进 VE 钙粘素内吞

讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:VE钙粘素调节血管内皮细胞通透性的相关分子机制

致谢

个人简历

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摘要

利用肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae, C.pn)体外感染人脐静脉内皮细胞系 EA.hy926细胞模型,观察 C.pn感染对血管内皮细胞(Vascular endothelial cell, VEC)通透性的影响,并从血管内皮细胞钙粘素(Vascular endothelial cadherin, VE cadherin)内吞的角度探讨 C.pn感染增加VEC通透性的机制,证实 C.pn感染可通过促使 VE钙粘素磷酸化促进 VE钙粘素内吞而增加 VEC通透性。
  方法:
  1.免疫荧光法检测 VEC生长致密时的细胞间连接;
  2.测量累计荧光透过率检测 C.pn感染对 VEC通透性的影响;
  3. CCK-8实验检测氯喹在作用时间和工作浓度内对VEC的毒性;
  4.用氯喹处理 VEC后,采用免疫荧光法观察 C.pn感染后对 VE钙粘素内吞的影响;
  5. CCK-8实验检测血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在作用时间和工作浓度内对 VEC的毒性;
  6.应用Western blot实验检测 C.pn感染VEC后VE钙粘素总蛋白表达水平的变化;
  7.利用质膜提取试剂盒提取 VEC细胞膜蛋白或以胰酶去除细胞膜后提取VEC胞浆蛋白,应用Western blot实验观察 C.pn感染后 VE钙粘素的内吞情况;
  8. CCK-8实验检测内吞抑制剂氯丙嗪在作用时间和工作浓度内对 VEC的毒性;
  9.测量累计荧光透过率检测加入氯丙嗪后,C.pn感染对 VEC通透性的影响;
  10.CCK-8实验检测缓激肽在作用时间和浓度内对 VEC的毒性;
  11.应用 Western blot实验检测Src激酶抑制剂PP2对 C.pn感染促进 VE钙粘素Y658位点磷酸化的影响;
  12.测量累计荧光透过率观察PP2对 C.pn感染增加 VEC通透性的影响;
  13.利用质膜提取试剂盒提取 VEC细胞膜蛋白或以胰酶去除细胞膜后提取VEC胞浆蛋白,应用Western blot实验检测PP2对 C.pn感染促进 VE钙粘素内吞的影响。
  结果:
  1.光学显微镜下可见,生长致密的VEC细胞间连接完整;
  2. C.pn感染 VEC0 h、18 h、24 h、36 h、48 h后,VEC通透性明显增高,其中以感染24 h后增高最为明显,差异具有统计学意义(P<0.05);
  3. CCK-8实验结果显示,以20μmol/l、40μmol/l、60μmol/l和80μmol/l工作浓度的氯喹处理 VEC24 h对 VEC活力无明显影响,差异无统计学意义,而以100μmol/l的氯喹处理 VEC24 h后,VEC活力明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);
  4.激光共聚焦结果显示,正常 VEC内呈特征性荧光绿色的 VE钙粘素均匀分布于细胞与细胞连接处。C.pn感染24 h后,VE钙粘素在 VEC胞膜处表达明显减少,但在胞浆中表达增多,且呈弥散分布,细胞间连接不再清晰分明,并出现明显缝隙。而氯喹处理后,C.pn感染引起的VE钙粘素由胞膜向胞浆内分布即VE钙粘素内吞更为明显。
  5. CCK-8实验结果显示,在工作时间内,工作浓度的VEGF对 VEC活力无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05);
  6. Western blot结果显示:C.pn感染组、VEGF组、C.pn感染+氯喹处理组、VEGF+氯喹处理组以及氯喹处理组与正常对照组相比,VE钙粘素总蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05);
  7. Western blot结果显示:C.pn感染组和VEGF处理组的细胞膜 VE钙粘素表达水平与正常对照组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05),而正常对照组细胞浆中仅能检测到少量的 VE钙粘素, C.pn感染组与 VEGF处理组的细胞浆中 VE钙粘素较正常对照组有所增加;应用溶酶体抑制剂氯喹抑制内吞的VE钙粘素降解后,C.pn感染+氯喹处理组与 C.pn感染组相比,其细胞膜上 VE钙粘素表达水平无明显差异,但前者细胞浆中 VE钙粘素表达水平较后者有所增加,差异具有统计学意义(P<0.05);VEGF+氯喹处理组与 VEGF处理组的 VEC细胞膜上 VE钙粘素表达水平无明显增加,但与后者相比,前者细胞浆中 VE钙粘素表达水平明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),提示C.pn感染可明显促进VE钙粘素内吞。
  8. CCK-8实验结果显示,在工作时间内,工作浓度的氯丙嗪对 VEC活力无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05);
  9.通过测量累计荧光透过率发现,加入氯丙嗪抑制VE钙粘素内吞后,C.pn感染引起的 VEC通透性增加被明显抑制(P<0.05);
  10.CCK-8实验结果显示,在工作时间内,工作浓度的缓激肽对 VEC活力无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05);
  11.Western blot结果显示:C.pn感染组和缓激肽处理组 VE钙粘素磷酸化水平较正常对照组显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);PP2+ C.pn感染组的 VE钙粘素磷酸化水平较 C.pn感染组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);
  12.累计荧光透过率检测结果显示,PP2预处理可削弱缓激肽促进VEC通透性增加的作用,差异具有统计学意义(P<0.05);同时,PP2预处理VEC后, C.pn感染增加VEC通透性的作用也明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05),提示C.pn感染可通过促进 VE钙粘素磷酸化而增加 VEC通透性;
  13.Western blot结果显示,C.pn感染组和缓激肽处理组的细胞膜VE钙粘素磷酸化水平与与正常对照组相比明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);而PP2+C.pn感染组的 VE钙粘素磷酸化水平较 C.pn感染组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);且在细胞浆中,C.pn感染组和缓激肽处理组的 VE钙粘素磷酸化水平较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);C.pn感染+氯喹处理组的 VE钙粘素 Y658位点的酪氨酸磷酸化水平较 C.pn感染组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  C.pn感染可能通过促进 VE钙粘素 Y658位点的磷酸化促进 VE钙粘素内吞,进而增加 VEC通透性。

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