鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因序列分析与原核表达产物免疫原性研究

摘要

本文根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列，用OLIG06.0设计PCR引物，对甘露糖敏感血凝试验(MSHA)检测阳性的鸭源致病性大肠杆菌pilA基因进行PCR扩增、序列测定及生物信息学分析；并对pilA基因进行原核表达和免疫原性检测，获得如下结果： 应用MSHA对实验室分离、鉴定的185株鸭源致病性大肠杆菌进行Ⅰ型菌毛检测，阳性率为65.9％(122/185)；选取25株MSHA阳性的菌株，用PCR扩增其pilA基因，其中21株为阳性，阳性率为84％。 测定和分析了5株(GH1.2,CY1.3,EM2.5,SL3.2,YL4.3)鸭源致病性大肠杆菌pilA基因表明：鸭源致病性大肠杆菌pilA基因大小为549bp，编码182aa，各株之间pilA基因核苷酸同源性为92.4％-100.0％，所编码氨基酸同源性为92.9％-100％；与人源、鸡源及猪源大肠杆菌pilA基因之间核苷酸同源性为87.3％-99.8％，氨基酸同源性为87.5％-99.5％。对不同宿主来源大肠杆菌pilA基因所编码蛋白的二级结构、亲水性、抗原性、抗原表位进行预测分析比较，结果显示Ⅰ型菌毛间具有一定的结构相似性，并存在一定的共同抗原位点；系统进化树分析表明，各菌株间的遗传相关性与其宿主来源及血清型之间没有严格的关系。 对菌株GH1.2扩增的pilA基因进行pMD18-T载体克隆，通过对pMD18-T-pilA及pET-32a(+)进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切、连接，将pilA基因定向插入pET-32a(+)，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定表明，成功构建重组表达质粒pET-32a-pilA，并转化入表达宿主菌BL21(DE3)，用IPTG进行诱导表达，表达产物以融合表达的包涵体形式存在，大小为36kD左右。对表达条件进行优化，确定最佳表达条件为IPTG0.2mmol/L，诱导4h。 表达产物用SDS-PAGE切胶及利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析两种方法对其进行纯化，均获得较好的纯化效果。纯化后产物两次免疫雏鸭，两周ELISA抗体效价达1∶1600，对同源菌株GH1.2的感染具有良好保护效果，将切胶及过柱纯化蛋白分别对兔进行免疫，制备了纯化蛋白的兔高免血清，WesternBlotting检测显示，与重组表达蛋白特异性结合；ELISA效价均高达1∶12800。

目录

论文独创性声明及关于论文使用授权的声明

1前言

2实验材料

3实验方法

4结果与分析

4讨论

5结论

参考文献

致谢

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