鹅GnIH及其受体基因的克隆、组织表达以及在颗粒细胞中的研究

摘要

促性腺激素抑制激素(GnIH)能以剂量依赖的模式作用于垂体前叶减少促性腺激素的释放，是目前发现的唯一能抑制生殖系统发育和功能的神经肽。GnIH能从下丘脑、垂体和性腺三个方面同时对繁殖进行调节。除了繁殖方面，它还在压力反射、摄食调节和季节性繁殖等多个方面起着重要的调节作用。为了研究GnIH对鹅繁殖的影响，本试验检测了GnIH及其两个受体RFRPR和NPFFR在产蛋高峰期母鹅不同组织中的表达，并以鹅卵巢颗粒细胞为研究模型，通过添加不同浓度的外源GnIH处理，分析了GnIH对鹅卵巢颗粒细胞功能的影响。主要研究结果如下:
　　(1)获得了GnIH前体mRNA、RFRPR、NPFFR的编码区部分CDS区序列。通过序列分析和氨基酸比对，发现RFRPR与NPFFR之间碱基序列的同源性为65.35％，并且都具有7个相似的氨基酸跨膜结构域。
　　(2)分析了GnIH前体mRNA在产蛋高峰期母鹅不同组织的表达模式。发现GnIH在下丘脑中的表达最高，除了脑部外，在肾上腺、输卵管和卵巢中也有表达，说明GnIH主要的合成场所是下丘脑。
　　(3) RFRPR和NPFFR主要在脑部表达。RFRPR更符合GnIH免疫神经纤维的分布，推测RFRPR是鹅GnIH的主要受体。RFRPR在肾上腺和眼球中的表达，表明GnIH参与了压力反射和季节性繁殖调控。RFRPR在卵巢中也有表达，表明GnIH能直接调控卵巢的功能。
　　(4)以体外培养的鹅卵泡颗粒细胞为研究模型，通过在培养基中人为地添加外源GnIH(0、0.1、10、1000 ng/ml)处理细胞，结果表明GnIH能影响颗粒细胞类固醇激素的合成与分泌。外源的GnIH能降低颗粒细胞中StAR、3β-HSD和CYP19基因的表达，也能减少雌二醇和孕酮的分泌。
　　(5)外源GnIH能够降低颗粒细胞的活性，促进细胞的凋亡而减少细胞的增殖，降低细胞中CCND1、CCND2和Bcl-2基因的表达。
　　(6)在GnIH处理的细胞中，GnIH能下调LH-R和FSH-R的表达，但对GnRH和RFRPR的表达影响却并不显著，表明GnIH对颗粒细胞的调控可能是通过LH-R和FSH-R来实现的。

目录

论文说明

声明

摘要

主要符号说明

前言

1 文献综述

1．1 GnIH的发现以及在脑部的定位

1．2 GnIH受体的鉴别

1．3 GnIH的表达与释放

1．3．1 褪黑激素对GnIH的调控

1．3．2 压力对GnIH的调控

1．4 GnIH在垂体中的研究

1．5 GnIH在生殖腺中的重要作用

1．6 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 主要试验器材与软件

2．1．3 主要试剂和试剂盒

2．1．4 主要试剂与配制

2．2 试验方法

2．2．1 目的基因部分序列的获得

2．2．2 鹅颗粒细胞的培养

2．2．3 不同浓度GnIH处理鹅颗粒细胞

2．2．4 鹅各组织及颗粒细胞中GnIH相关基因mRNA表达水平检测

2．2．5 不同浓度GnIH处理鹅颗粒细胞后雌二醇和孕酮分泌的变化

2．2．6 不同浓度GnIH处理鹅颗粒细胞的BrdU免疫组化染色

2．2．7 不同浓度GnIH处理鹅颗粒细胞的TUNEL免疫组化染色

2．2．8 GnIH对颗粒细胞活性的影响

3 结果与分析

3．1 鹅RFRPR和NPFFR基因部分序列的获得

3．1．1 鹅组织RNA的提取和RT-PCR结果

3．1．2 基因同源性分析及分子进化树的构建

3．1．3 蛋白质结构比对与分析

3．2 鹅各组织中GnIH、RFRPR和NPFFR的mRNA表达水平

3．3 GnIH对颗粒细胞类固醇激素合成与分泌的影响

3．3．1 GnIH对颗粒细胞E2和P4的分泌影响

3．3．2 GnIH对颗粒细胞类固醇激素合成相关基因的调控

3．4 GnIH对颗粒细胞凋亡的影响

3．4．1 GnIH对颗粒细胞活性的影响

3．4．2 BrdU和TUNEL免疫组化实验

3．4．3 GnIH对增殖与凋亡相关基因的影响

3．5 GnIH的相关调控

4 讨论

4．1 基因进化分析

4．2 GnIH及其受体基因在鹅不同组织中的表达

4．3 GnIH能抑制颗粒细胞类固醇激素的合成与分泌

4．4 GnIH促进颗粒细胞凋亡

4．5 GnIH能通过LH-R和FSH-R来实现对颗粒细胞的调节

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文及著作