盐生杜氏藻促有丝分裂活化蛋白激酶基因的克隆及表达研究

摘要

促有丝分裂活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径是真核生物中广泛存在的将信号从胞外传递到胞内的应答调控途径。它参与细胞增殖，分化，生物和非生物胁迫等多种生理过程相关的信号传导。MAPK 途径采用保守的三级激酶，分别名为：MAPKKK(MEKK)、MAPKK(MEK)、MAPK，级联传递信号。在细胞膜信号受体感受到胞外信号后，激活相应的信号蛋白使MEKK活化进入MAPK途径。活化的MEKK激活MEK，而后MEK磷酸化MAPK的TxY活化区激活MAPK。活化后的MAPK通过调节细胞质中相关蛋白的活性或进入细胞核调控功能基因的表达，实现信号调控的作用。MAPK在人、酵母和植物中已经有深入的研究，而在藻类中只有少数的MAPK基因被克隆。盐生杜氏藻(Dunaliella salina，盐藻)是目前世界上最耐盐的真核光合生物，主要生活在一些盐湖盐田以及海洋等高盐环境中。本论文在实验室从盐藻cDNA文库中获得的MAPK基因EST序列的基础上，开展了对盐生杜氏藻MAPK基因克隆与表达的研究。 通过RACE的方法从杜氏藻中克隆到MAPK 基因的全长cDNA序列，将其编码的MAPK其命名为DsMPK。序列中包含一个完整的ORF区编码472个氨基酸，193bp的5’-UTR和237bp的3’-UTR。分析翻译所得氨基酸序列发现，其与衣藻、拟南芥等植物的MAPK氨基酸序列有高相似性(74％CrMPK，60％ AtMPK4，63％AtMPK6，62％AtMPK3)。保守功能结构域分析不仅确定了其具有磷酸激酶的活性催化区，同时发现DsMPK的C端延长序列具有由谷氨酰胺形成的低复杂性序列。其后的蛋白质性质分析确定了该延长区具有高度亲水性，这与酿酒酵母中的Hogl (MAPK)的 C端有着相似的性质。通过氨基酸序列多重序列比对确定了DsMPK 保守的TEY活化区和与支架蛋白结合相关的CD模体。从根据氨基酸序列构建的进化树可以发现已知的藻类MAPK相似性介于高等植物A、B类与C类MAPK之间。为确定DsMPK的进化地位，克隆了DsMPK的基因组序列并分析了其进化地位。先以Southern杂交分析确定DsMPK在基因组中是以单拷贝存在，这与其他物种相似。而后运用分段克隆的方法获得了包含ORF区的基因组DNA序列。该序列具有2个外内含子和3个外显子。两个内含子都遵守GT-AG的边界法则。前两个外显子较短，第三个外显子最长。翻译的起始密码子ATG在第一外显子内，而DsMPK主要的功能和结构域几乎都位于第三个外显子内。通过将DsMPK基因组序列与植物中MAPK基因组序列比较发现，DsMPK第二内含子与植物中A、B类MAPK的第一内含子同源。因而，可以确定DsMPK的与植物A、B类MAPK的同源性更高。 而后，对盐藻在高渗和低温处理后表达变化进行了分析，发现DsMPK基因表达与胁迫相关。用ORT-PCR分析在胁迫中DsMPK基因表达的变化，发现其在两种胁迫中表达量随时间逐渐降低，在6h后达到最低点。这与植物中有的胁迫相关MAPK基因表达相似，表明DsMPK的调控作用不是通过转录水平的调控，而可能通过磷酸化修饰的作用。为进一步确定DsMPK 在胁迫中的调控作用，将进行蛋白和酶活的分析。 因此，构建了DsMPK的原核表达和纯化体系，获得了较纯的DsMPK融合蛋白，为抗体制备和酶活分析提供材料。实验中将 DsMPK基因序列克隆到pET32a原核表达载体中，实现了DsMPK基因其在大肠杆菌BL21中的高效表达，并用金属离子螯合层析纯化获得了DsMPK融合蛋白。 通过对盐生杜氏藻促分裂原活化蛋白激酶基因的克隆与表达研究，获得了DsMPK基因，以及包含ORF区的基因组序列，确定了DsMPK的进化地位，分析了DsMPK基因在盐胁迫和冷胁迫中的表达变化，并在原核中成功表达且纯化获得了DsMPK融合蛋白。为全面了解盐藻在胁迫条件下的生理调节机制，深入研究盐藻在胁迫环境下MAPK基因家族在信号调控中的作用，建立耐盐生物中的MAPK信号调控模式，以及MAPK基因家族的进化分析奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章盐生杜氏藻MAPK基因的克隆

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1 MAPK的EST分析

2.2盐生杜氏藻RNA的提取

2.3 MAPK的3’-RACE

2.4 MAPK的5'-RACE

2.5全长cDNA序列拼接及验证

3.讨论

3.1 RNA的提取

3.2 MAPK的末端快速扩增

3.3全长cDNA序列分析

第二章盐生杜氏藻MAPK基因的生物信息学分析

1.分析方法

1.1核苷酸序列分析

1.2蛋白质序列分析

2.结果与讨论

2.1核酸序列分析

2.2蛋白质序列分析

第三章盐生杜氏藻MAPK基因组序列的克隆与进化分析

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1基因组DNA提取

2.2 Southern杂交分析

2.3基因组片段克隆

2.4基因组序列内含子和外显子分布分析

3.讨论

3.1基因组DNA的提取

3.2 Southern杂交

3.3基因组DNA序列克隆

3.4基因组序列的内含子和外显子分布分析

第四章胁迫对盐生杜氏MAPK基因转录水平的影响

1.材料和方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1 RNA提取的检测

2.2引物特异性的检测

2.3 QRT-PCR结果

3.讨论

3.1荧光定量PCR条件优化

3.2 DsMPK基因的差异表达

第五章盐生杜氏藻MAPK的原核表达及纯化

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 ORF序列的扩增和载体的构建

2.2融合蛋白的表达与条件的优化

2.3融合蛋白的纯化、透析和浓缩

3.讨论

3.1 ORF的扩增和载体的构建

3.2融合蛋白的表达优化

3.3融合蛋白的纯化及浓缩保存

结论

参考文献

综述：植物在盐胁迫中的应答和调控

在读期间科研成果

致谢