美洲大蠊抗肿瘤活性成分及其结肠定位片的研究

摘要

美洲大蠊Periplaneta americana（L.）为昆虫纲（Insecta），蜚蠊目(Blattodea)，蜚蠊科(Blattaria)昆虫的干燥全体。具有活血化瘀、解毒消疳、利水消肿等功效，含有蛋白质、氨基酸、肽类、糖类等多种有效成分，现代研究表明，在抗癌、提高免疫力、治疗心血管疾病、修复皮肤等方面具有显著的作用。本论文在文献及前期工作基础上，以美洲大蠊为研究对象，富集纯化其多肽类抗肿瘤活性成分，再根据多肽类成分在胃肠道中易被酸解、酶解而失去药效的性质，采用新技术、新工艺将其研制成pH敏感型口服结肠定位片，主要研究内容如下：
　　1.美洲大蠊抗肿瘤有效部位的制备工艺研究：采用指标成分含量检测结合体外肿瘤细胞抑制试验，确定了美洲大蠊有效部位的制备工艺条件为：取美洲大蠊药材粗粉，石油醚除脂后，用10倍量90％的乙醇浸泡48h，以3ml/min/kg的速度进行渗漉，收集渗漉液，滤过，滤液在50℃～60℃减压浓缩至1:1（ml:g），药液通过HP20大孔树脂，用2BV70%的乙醇进行洗脱，收集70%乙醇洗脱液，并在50℃～60℃下减压浓缩至1:2（ml:g），冷冻干燥即得多肽类冻干粉。
　　2.美洲大蠊冻干粉的初步质量标准研究：采用紫外-可见分光光度法对冻干粉中氨基酸、多肽含量进行测定；HPLC法对尿嘧啶、次黄嘌呤、肌酐含量进行测定；对冻干粉中氨基酸的种类和含量进行检测；Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳测定了冻干粉中多肽的分子量，初步建立了美洲大蠊多肽类冻干粉的质量标准。
　　3.美洲大蠊冻干粉的抗肿瘤作用及其机制的研究：在前期研究的基础上，对其体内抗肿瘤活性、荷瘤小鼠免疫功能及对SMMC-7721细胞凋亡的影响进行了研究。结果表明：美洲大蠊冻干粉各剂量组能抑制荷H22和S180瘤小鼠肿瘤生长，同时能提高荷瘤机体的免疫功能；可明显诱导SMMC-7721细胞凋亡，抑制其增殖，呈现出一定的量效关系，其机制可能与下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，降低Bcl-2/Bax比值有关，初步揭示了美洲大蠊抗肿瘤的作用机制。
　　4.美洲大蠊冻干粉结肠定位片的制备研究：根据美洲大蠊抗肿瘤活性多肽的性质，为避免多肽成分在胃肠道中易被酸解、酶解而失去药效，选择pH敏感型包衣材料Eudragit S100将冻干粉制成结肠定位片剂，有利于药物的吸收，发挥持久的药效。在制备合格素片的基础上，以肌酐的累积释放度为指标，确定具有结肠定位的包衣处方及包衣工艺参数，制备了美洲大蠊结肠定位片。三批样品药物的释放行为相似，达到结肠定位释放的目的，对样品的释药曲线进行模型拟合，发现美洲大蠊冻干粉结肠定位片的体外释药行为符合威布尔模型。
　　本论文对美洲大蠊抗肿瘤活性多肽进行初步分离，制备了美洲大蠊抗肿瘤活性部位；建立了冻干粉的初步质量标准；对其进行抗肿瘤机制的研究，成功研制了pH依赖型口服结肠定位片，经体外释放度试验证明能准确定位到结肠，并满足药物溶出的要求，以期为临床提供高效、低毒、多样的用药选择。
　　创新点：
　　1.思路创新
　　本论文从美洲大蠊抗肿瘤有效部位的提取与纯化，冻干粉的制备，初步质量标准的建立，抗肿瘤作用及其机制的探讨，结肠定位片的研制，形成“提取工艺—化学成分—药效作用—成型工艺”的系统研究，为深入研究动物类中药新制剂提供新思路，具有创新性。
　　2.方法创新
　　本论文采用化学指标与药效学实验指标相结合，对美洲大蠊抗肿瘤活性成分进行富集和纯化工艺；采用western-blot法、Elisa法、Hoechst33342/PI双染法、Annexin V-FITC/PI双染法等分析方法对美洲大蠊有效部位体内外抗肿瘤作用及机制进行研究。在制备结肠定位片中，采用肌酐溶出度结合f2相似因子法对比不同处方、工艺条件的累积释放曲线，对其体外释药相似性进行评价，为动物类中药美洲大蠊结肠定位释放研究提供新方法，具有创新性。
　　3.应用创新
　　本论文通过体内抗肿瘤活性、荷瘤小鼠免疫功能及对体外肿瘤细胞凋亡的影响初步揭示其抗肿瘤作用的机制，为其抗肿瘤药物的开发奠定基础；美洲大蠊抗肿瘤成分为多肽类活性成分，在胃肠道中易被酸解、酶解，不易被吸收进入血液，失去生物学活性，故本论文将其制备成结肠定位片，扩大美洲大蠊临床应用，具有创新性。

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第一章 引 言

1 中医对肿瘤的认识与治疗优势

2 西医对肿瘤的认识与治疗方法

3 美洲大蠊研究现状

4 结肠定位制剂的研究现状

5 研究内容与意义

第二章 美洲大蠊抗肿瘤有效部位的制备工艺研究

1材料与仪器

2 细胞培养、传代、冻存及复苏

3 美洲大蠊不同提取方法对肿瘤细胞的影响

4 美洲大蠊乙醇渗漉工艺的研究

5 浓缩工艺研究

6 分离纯化工艺研究

7 冷冻干燥工艺确定

8 中试研究

9 本章小结

第三章 美洲大蠊冻干粉的初步质量标准研究

1 材料与仪器

2 名称

3 来源

4 制法

5 性状

6 TLC鉴别

7 含量测定

8 氨基酸组成分析与相对含量检测

9 多肽的分子量研究

10 本章小结

第四章 美洲大蠊冻干粉的抗肿瘤作用及其机制的研究

1材料与仪器

2美洲大蠊冻干粉对荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响

3美洲大蠊冻干粉对SMMC-7721细胞凋亡的影响

4本章小结

第五章 美洲大蠊有效部位结肠定位片的制备研究

1 材料与仪器

2 美洲大蠊冻干粉素片的制备

3 美洲大蠊结肠定位片体外分析方法的建立

4 pH敏感型结肠定位片的包衣工艺研究

5 pH敏感型结肠定位片的释药机制研究

6 本章小结

全文总结

1 结论

2 讨论与展望

3 创新性

参考文献

致谢

综述: 浅析活性多肽抗肿瘤作用的研究现状

在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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