双向凝胶电泳联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析在膝关节骨性关节炎滑液蛋白质组学研究中的应用

摘要

目的:
　　联合运用双向凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,研究膝关节骨性关节炎(KOA)与非KOA关节滑液蛋白质组表达图谱的差异,进一步阐述KOA的发病机制,寻找并初步明确KOA关节滑液中的特异性生物学标志,为该病的早期诊治、疗效监测和预后评估提供可靠的、准确灵敏的实验室参考指标。
　　方法:
　　收集2011年8月-2012年4月在解放军总医院行关节镜诊治的12例KOA患者与12例非KOA膝关节疾病患者(半月板损伤10例,盘状半月板2例,均无明显关节软骨损伤)关节滑液标本。KOA患者疾病严重程度分级采用Kellgren-Lawrence(KL)放射学分级标准。2-DE的第一向电泳采用固相PH梯度电泳,第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析关节滑液蛋白质组成分。电泳后经质谱兼容银染,ImageMaster2DPlatinum软件分析,将有统计学差异的蛋白质点胶内胰蛋白酶解,经MALDI-TOF-MS鉴定分析,定性后采用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量分析部分具有潜在临床意义的蛋白。
　　结果:
　　KOA患者与非KOA膝关节疾病患者关节滑液相比较,经2-DE-质谱技术分析,共鉴定出31个具有统计学差异的蛋白(p<0.05),差异点分布在pI3.0-10.0、分子量14.0kDa-97.0kDa之间。其中25个(80.6％)被认为具有潜在的临床意义。在这25个蛋白中,有12个(48%)结构蛋白,5个(20%)代谢酶类,2个(8%)转运蛋白,2个(8%)免疫球蛋白,4个(16%)其它类型蛋白。其中20个(80%)在KOA滑液中表达上调,5个(20%)表达下调。组织相容性白细胞抗原-DR(HLA-DR)、结合珠蛋白在KOA中表达上调,且与病情严重程度高度相关。
　　结论:
　　1.根据蛋白质不同的分子量和等电点,通过2-DE可分离关节滑液中蛋白质成分,并可利用分析软件找到KOA关节滑液中的差异蛋白质。
　　2.KOA与非KOA相比,在关节滑液蛋白质组成分中存在差异。
　　3.找到的某些差异蛋白质可能在KOA的发病机制中具有重要作用,并可作为特异性生物学标志用于该病的早期诊治、疗效监测和预后评估。

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第一章 前言

参考文献

实验流程图

第二章 双向凝胶电泳

第一节 材料与方法

1. 实验对象

2. 诊断、纳入和排除标准以及实验分组和分级

3. 关节滑液的抽取及储存

4. 主要仪器设备

5. 实验用试剂

6. Bradford法蛋白定量

7. 双向凝胶电泳

8. 银染

9. 凝胶图像分析

第二节 结果

第三章 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

第一节 材料与方法

1. 仪器设备与试剂

2. 胶内酶切和肽段提取

3. MALDI-TOF-MS分析

4. 蛋白质序列数据库检索

第二节 结果

第四章 酶联免疫吸附试验

第一节 材料与方法

1. 实验对象

2. 差异蛋白的定量检测

3. 统计分析

第二节 结果

第五章 讨论

1. 组织相容性白细胞抗原-DR(HLA-DR)

2. 结合珠蛋白(Hp)

3. 载脂蛋白(Apo)

4. 与细胞生长发育和增殖相关的蛋白

5. 与免疫机制相关的蛋白

1. 关节滑液样本获取、预处理及上样量的选择

2. IPG胶条溶胀及等电聚焦参数设定

3. 两向之间的平衡

4. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

5. 染色

第六章 总结

参考文献

中英文缩略词表

文献综述

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢