复合雪旺细胞的小肠粘膜下层构建组织工程化人工神经修复周围神经缺损的研究

摘要

长距离周围神经缺损的修复,一直是临床上较为棘手的难题。目前临床上最常用的治疗是自体神经移植,但是它存在着明显的缺点,如可供移植的神经数量和长度有限,造成供区的功能障碍,大小难以匹配和可造成错向再生等。近年来,利用组织工程技术研制一种可替代自体神经移植的人工神经是研究的热点。雪旺细胞(Schwann cells, SCs)在周围神经的发生、发育、形态、功能维持方面发挥着非常重要的作用,已被广泛用作周围神经组织工程的种子细胞。除了种子细胞以外,合适的支架材料是构建组织工程化人工神经的关键。目前主要应用于修复周围神经缺损的材料包括人工合成的材料如各种聚合物,和天然材料如血管、变性肌肉、胶原、明胶等。但是这些材料都存在着一定的缺点,迄今为止尚不能真正地在临床上替代自体神经移植修复长距离周围神经缺损。小肠粘膜下层(small intestinal submucosa, SIS)是一种天然的细胞外基质材料,接近于天然结缔组织复杂的成份结构,其结构与细胞更具有亲和力。作为一种生物材料,SIS中既不含血管又不含细胞,作为异种移植物植入体内,不会引起明显有害的免疫排斥反应。目前SIS已作为组织工程的支架材料广泛应用于下尿路、膀胱、血管、肌腱、韧带、骨、半月板、腹壁、硬脑膜、筋膜等多种组织缺损修复的实验研究和临床研究中,取得了令人满意的效果,具有非常良好的应用前景。我们曾应用单纯猪SIS修复大鼠1cm短距离坐骨神经缺损,取得了良好的实验结果。本实验首先在体外分离培养新生鼠雪旺细胞,并进行纯化、鉴定和传代。制备好SIS并进行生长因子检测和生物安全性评价。然后将SIS与雪旺细胞进行体外复合培养并检测两者的生物相容性。以雪旺细胞为种子细胞,SIS为支架材料,构建组织工程化人工神经导管来修复大鼠14mm坐骨神经缺损,并与单纯SIS导管和自体神经移植作对照,通过多种方法综合分析评价修复效果和机制,探讨其修复长距离周围神经缺损的可行性。首先,探讨新生鼠雪旺细胞体外分离培养和纯化的方法。通过酶消化法从新生鼠的周围神经体外初步分离出雪旺细胞,24h后加入阿糖胞苷(10-5mol/L)以抑制成纤维细胞生长,传代时应用差速贴壁法进一步去除成纤维细胞,达到纯化雪旺细胞的目的。培养液中加入牛脑垂体浸出液(40μg/ml)刺激雪旺细胞的迅速分裂增殖,这样可获得大量纯度高达97%的雪旺细胞作为种子细胞。本方法具有简单方便、耗时少和细胞纯度高等优点。其次,进行SIS的制备、生长因子检测和生物安全性评价。首先通过机械刮除方法去除粘膜层、肌层和浆膜层,初步得到SIS。进一步应用化学方法进行脱细胞和灭菌处理。最后冻干消毒后保存。经光镜和扫描电镜检测表明制备好的SIS已基本去除残留细胞,没有对其超微结构和胶原纤维的热稳定性造成损害,具有适合细胞生长的三维结构,可用作周围神经组织工程的支架材料。ELISA法检测证实,SIS中含有血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子-β(TGF-β),其含量与文献报道基本一致。热源试验显示动物注射SIS浸提液后体温升高在允许范围内,说明没有热源物质残留。皮肤刺激试验和体内植入研究发现,无脓肿及瘘管形成,组织切片发现SIS植入后组织反应在早期呈现出异物刺激引起轻中度炎性反应,中期时炎症细胞减少,以淋巴细胞为主,炎症反应和抗原反应都较小,同时进行程序性的降解。12周时SIS几乎完全降解吸收。未见肌肉组织变性和坏死。血清IgG亚型检测见SIS植入第1周时小鼠血清中IgG1亚型明显增高,第4周时达到最高值,然后逐渐开始下降,12周时接近于正常。而IgG2a,IgG2b亚型在SIS植入体内整个期间并无较大的波动。结果证实我们制备的SIS作为一种异种来源生物材料,具有较好的组织相容性,对机体全身和局部无毒性,植入体内后并不会引起明显的对受体有害的炎症和免疫排斥反应,能够安全地应用于机体内修复组织缺损。再次,将制备好的SIS与雪旺细胞在体外进行复合培养并研究其生物相容性。将雪旺细胞悬液滴种于SIS表面,不同时间段观察雪旺细胞在SIS上的粘附、增殖、分化及细胞活性情况,并检测细胞的神经营养因子的分泌活性。MTT法证实雪旺细胞在SIS表面有良好的增殖活性, SIS对雪旺细胞并无细胞毒性作用。相差显微镜、组织切片和扫描电镜可见雪旺细胞在SIS表面附着和生长增殖良好,附着于材料的孔隙周边或深入材料孔隙内生长,5~7天后逐渐长满材料表面。雪旺细胞分裂增殖呈三维生长,细胞形态多为长梭形,纺锤形或长三角形,突起显著,细胞呈端对端的相互连接或排列成束状或栅栏状,细胞表面蛋白颗粒分泌良好。透射电镜可见SIS表面雪旺旺细胞生长状态良好,细胞胞体呈长梭形,膜表面有微绒毛突起,细胞紧密贴附生长于SIS表面,局部可见重叠生长。细胞质内见核糖体和线粒体丰富,分布于核周。雪旺细胞与SIS交界部见细胞底部形成许多突起与SIS紧密接触。此外,通过ELISA检测发现雪旺细胞与SIS复合培养后分泌NGF-β和BDNF的神经营养因子功能良好,分泌量随着时间的延长而逐渐增高,与正常培养的雪旺细胞无显著性差异。RT-PCR结果显示雪旺细胞与SIS复合培养后NGF-βmRNA和BDNF mRNA均表达良好。同时还证实雪旺细胞与SIS复合培养后5~7天时,雪旺细胞在SIS表面生长的密度较高,细胞因子分泌水平也达到较高的水平,是进行体内移植的最佳时期。本实验结果证明SIS与雪旺细胞具有良好的生物相容性,为进一步利用SIS与雪旺细胞复合构建人工神经导管进行体内实验研究打下基础。最后,以雪旺细胞为种子细胞,SIS为支架材料,体外复合培养后构建组织工程化人工神经来修复大鼠14mm坐骨神经缺损,以单纯SIS导管和自体神经移植作对照。通过大体观察、电生理检测、组织学、免疫组化、图像分析、超微结构、逆行示踪和血供重建等多方面分析评价修复效果和机制。结果显示,术后16周,SIS复合雪旺细胞组患肢溃疡基本愈合,移植段与近、远坐骨神经直径相当,外观相似,未见神经瘤形成,外膜表面可见丰富的再生血管网。电生理功能检测见神经传导速度(NCV)和复合动作电位的波幅(AMP)与自体神经移植组相比无显著差异。组织学检查示再生神经纤维已顺利通过缺损区,排列整齐呈束状,含有大量的有髓神经纤维,且髓鞘较厚。图像分析见再生神经组织面积百分比、有髓神经纤维密度和髓鞘厚度与自体神经移植组相比无显著差异。NF-160/200免疫组化染色结果显示,再生神经纤维中阳性表达量较多,排列整齐,连续性较好,与自体神经移植组相似。透射电镜见再生神经纤维呈较成熟形态学表现,粗细不等的有髓及无髓纤维较均匀地分布,髓鞘板层清晰。大鼠小腿三头肌重量接近于自体神经移植。逆行示踪检测显示大量真蓝标记阳性的L3~6背根神经节感觉神经元和脊髓前角运动神经元,证实再生感觉神经纤维和运动神经纤维传入通路均通畅。通过血管墨汁灌注和核素扫描方法进行血供重建分析证实了神经缺损局部血供重建良好。实验结果证实,SIS复合雪旺细胞构建的组织工程化人工神经可以成功修复大鼠长距离周围神经缺损,其效果接近于自体神经移植。它可能通过SIS表面特殊三维结构、含有多种细胞因子、有利于雪旺细胞粘附、生长和分泌神经营养因子、促进微循环重建等多种机制促进周围神经缺损的修复。有望通过进一步深入地研究和改进,将来应用于临床上真正地替代自体神经移植修复长距离周围神经缺损。

目录

摘要

Abstract

第一章 引言

第二章 新生鼠雪旺细胞的体外分离培养、纯化和鉴定

前言

材料与方法

结果

讨论

本章小结

第三章 小肠粘膜下层的制备、生长因子检测和生物安全性评价

前言

材料与方法

结果

讨论

本章小结

第四章 SIS 与雪旺细胞体外复合培养及其生物相容性的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

本章小结

第五章 SIS 复合雪旺细胞构建组织工程化人工神经修复大鼠坐骨神经缺损

前言

材料与方法

结果

讨论

本章小结

全文总结

参考文献

致谢

附录 1 综述一

附录 2 综述二

攻读博士学位期间发表的学术论文和参编专著目录