神经母细胞瘤细胞鉴定与微小残留病检测研究

摘要

目的: 阐明神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)骨髓微量肿瘤病灶（minimal residual disease, MRD）检测方法及结果对预后的影响；建立NB骨髓转移细胞的体外培养与鉴定实验方法。 方法: 1、应用CD45-FITC/CD81-PE/CD56-PECy5单抗组合通过流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测了人NB细胞株TGW的免疫表型并确定本实验室FCM的敏感度为1×10-4；比较Ⅲ～Ⅳ期NB患儿治疗前及治疗中骨髓细胞形态学检查与FCM检测BM中的CD45-/ CD81+/ CD56+细胞阳性率；通过对NB患儿治疗前及治疗不同阶段的BM MRD检测分析其应用价值。 2、应用荧光定量多聚酶链反应法（fluorescent quantitation-polymerase chain reaction,FQ-PCR）检测骨髓微量神经母细胞瘤细胞的酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)表达，建立了以TH为靶基因FQ-PCR方法检测微量神经母细胞瘤细胞的方法。共检测临床NB标本26例，其中包括24例骨髓标本，1例胸水标本和1例干细胞采集物，阴性对照为5例正常儿童和11例非神经母细胞瘤患儿骨髓。 3、我院血液科门诊及病房伴骨髓转移的NB患儿共17例,经骨髓穿刺发现NB细胞及病理确诊，患儿骨髓中瘤细胞镜检比例50-80％。无菌条件下取NB骨髓转移患者骨髓，用Ficoll分离单个核细胞，加入含有双抗（青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml）的20％胎牛血清DMEM/F12培养液中，接种于6孔培养板中5％C02, 37℃培养。在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况及形态学特点，同时分别应用FCM检测CD45-/ CD81+/ CD56+的表达、FQ-PCR方法检测TH的表达及免疫组化方法对原代培养的NB骨髓转移细胞进行鉴定。 结果: 1、比较了35例初诊时FCM检测BM MRD阳性患儿平均化疗4个疗程后MRD结果与预后关系，化疗4个疗程后15例患儿MRD转阴，其中5例复发，其余10例随访至今无复发及进展，无瘤生存平均时间23.77个月；另外20例患儿化疗4个疗程后MRD仍为阳性，其中10例患儿复发或进展，包括1例死亡，两组差异有统计学意义。比较了化疗后移植患儿外周血干细胞（peripheral blood stem cell, PBSC）采集前骨髓MRD结果与预后的相关性：共有24例患儿接受化疗后行外周血干细胞移植，18例患儿采集PBSC时骨髓MRD为阴性，其中5例患儿复发，自移植后始DFS平均时间32.45个月；6例患儿采集PBSC时骨髓MRD为阳性，5例复发，两组差异有统计学意义。 2、通过倍比稀释NB细胞于正常骨髓单个核细胞中，本文确定了FQ-PCR法的敏感性为1×10-5，即可检测到105个正常骨髓细胞中的一个肿瘤细胞。26例NB标本中阳性24例，阴性2例。阳性对照TGW细胞株表达TH；阴性对照组非肿瘤患儿和其他实体瘤患儿骨髓标本均不表达TH。相同的标本同时行骨髓细胞学检查及FCM检测，FQ-PCR阳性率为92.3％，FQ-PCR结果阳性者细胞学检查和FCM（76.9％）结果均为阳性。 3、我们对17例骨髓转移的NB患者进行NB骨髓转移细胞体外原代培养,传代超过15代有5例，其中2例超过20代，经FCM、FQ-PCR方法、免疫组化鉴定为NB细胞，最终细胞因反复传代失去强增殖能力。 结论: 1、运用FCM检测NB患儿BM中的MRD敏感度高、特异性强，可协助初诊NB患儿的诊断、评估临床疗效，BM中MRD残留与神经母细胞瘤预后相关. 2、FQ-PCR方法较FCM法敏感，可以用于治疗过程中监测MRD，指导治疗，影响预后，具有临床应用价值。 3、本实验建立NB骨髓转移细胞体外原代培养的实验技术，为将来建系提供了良好的实验基础与经验，为NB体外诱导逆转及多药耐药等复杂机制研究提供更接近体内生物学性状的细胞来源。