血栓法大鼠脑缺血模型的建立及药物干预后DWI和PWI演变规律

摘要

第一部分适用于延迟溶栓治疗的大鼠血栓法脑缺血模型的建立 目的: 评价一种适用于延迟溶栓治疗的急性血栓法大鼠脑缺血模型，旨在提高模型的可重复性和可控制性。 材料与方法:健康雄性成年Sprague-Dawley (SD) 大鼠55只，体重300-450g,随机分成3组：单纯缺血组(n=30)、延迟溶栓组(n=20)、对照组(n=5)。通过向大鼠颈内动脉内注入10～12个0.8-1.0mm富含纤维蛋白的自体血栓制作脑缺血模型，用MRI或HE评价脑梗死的部位、大小及栓塞后不同时间脑血流的变化、单纯缺血及延迟溶栓后脑出血情况，并观察大鼠的存活情况。 结果: 对照组MRI及HE均未发现异常。单纯缺血组和延迟溶栓组98％（49/50）的大鼠在血栓注入后脑内发现明确梗死灶，脑梗死仅位于同侧大脑半球的占91.84％（45/49），局限于左侧顶叶皮质、基底节的占89.80％（44/49），对侧大脑半球也出现梗塞灶占8.16％（4/49）；单纯缺血组在24 h或死亡时的平均脑梗死体积占同侧大脑半球的48.29 ± 18.57％；单纯缺血组大鼠在血栓注入后3h、6h、9h的rNEI分别为32.40±20.67％、39.43±33.50％、51.60±29.10％，各组间差异无明显统计学意义(P>0.05)，表明无血栓自溶再通；单纯缺血组有1例(3.33％)出现局灶性出血，延迟溶栓组有4例(20％)出现大面积出血。单纯缺血组有2只(6.67％)大鼠在24h内死亡，延迟溶栓组有10只(50％)大鼠在24h内死亡。 结论: 改良后的大鼠急性血栓法脑缺血模型具有良好的可重复性和可控性，梗死面积缩小，延迟溶栓后脑内出血和死亡率降低，可适用于延迟溶栓治疗。 第二部分急性血栓法大鼠脑缺血模型不同区域DWI和PWI的演变规律 目的：探讨血栓法大鼠脑缺血模型不同区域的PWI和DWI随时间变化的规律，确立评估急性脑缺血半影区的MRI特异指标及标准。 材料和方法：健康雄性成年SD大鼠30只，体重300-450g,按第一部分建立急性脑缺血模型。对成功建立的大鼠脑缺血模型在不同的时间段进行MRI扫描，分析rADC、rNEI、rTTM和rMSI的变化规律；大鼠在MRI检查结束后行HE、电镜、免疫组化检查、LSCM检查。 结果：缺血灶内不同部位均表现为rADC下降，中心区下降较边缘区明显。中心区24h内rADC无明显变化，24h后见rADC逐渐上升，3d～4d出现假正常化，而后继续升高，到14d达270％。边缘区的rADC于脑缺血后逐渐下降，6h～10h变化平缓，于6h～8h轻度回升，而后稍微下降，于10h达最低点74％，随后一直上升至5d为113％，7d后逐渐恢复至对侧相应区域水平。中心区与边缘区在脑缺血0.5h～4h、8h～24h存在显著差异（P<0.05），5h～7h、36h～5d无明显差异（P>0.05）。缺血中心区与边缘区rNEI变化相仿，缺血后0.5h即可见缺血区rNEI明显下降，中心区下降较边缘区明显，分别为17.83％和50.45％，然后不同部位的rNEI逐渐上升，至4d达最高水平，中心区与边缘区分别为131.66％和113.35％，随后逐渐下降，趋于对侧相应区域水平。中心区与边缘区在24h内不同时间rNEI均存在差异（P<0.05）。不同部位的rTTM呈下降改变，中心区rTTM值高于边缘区，不同时间缺血中心和边缘区域的rTTM存在交叉重叠，难以分辨其差异。缺血中心区和边缘区rMSI均降低，中心较边缘明显，脑缺血3h内呈下降改变，随后逐渐升高，缺血中心区与边缘区rMSI于脑缺血后不同时间存在交叉重叠。动态观察rADC与rNEI的演变规律并与病理对照，我们认为，在脑缺血早期，rADC<70％，提示脑组织已处于不可逆状态。 结论：动态观察DWI及PWI演变规律，可以了解脑缺血后不同区域的血流及病理生理改变，区分可挽救组织与坏死组织，为溶栓治疗时间窗提供个体化信息,成为指导治疗、选择治疗方法及判断疾病预后的指标。 第三部分急性血栓法大鼠脑缺血模型药物干预后不同区域DWI和PWI演变规律 目的：评价rt-PA溶栓治疗联合人体白蛋白与硫酸镁延长溶栓时间窗的可能性和可靠性。 材料和方法：按第一部分成功建立的血栓法大鼠脑缺血模型90只,随机分为A、B、C三组，即A组：rt-PA单纯溶栓，B组：rt-PA溶栓+人体白蛋白，C组：rt-PA溶栓+人体白蛋白+硫酸镁，每组又根据脑缺血时间的不同分为3h、6h、9h亚组，每小组10只。A组在脑缺血的不同时间将rt-PA(10mg/kg)自大鼠右侧股静脉缓慢注入，在1h内完成；B组在脑缺血的不同时间将rt-PA(10mg/kg)与人体白蛋白(2.5g/kg)自大鼠右侧股静脉轮流缓慢注入，在2h内完成；C组在脑缺血后3h将5％硫酸镁溶液自腹腔注射(500mg/kg)，然后在脑缺血的不同时间将rt-PA(10mg/kg)与人体白蛋白(2.5g/kg)自大鼠右侧股静脉轮流缓慢注入，在2h内完成，在治疗后12h再次经腹腔注入同样剂量的硫酸镁。于治疗前1h内、治疗后24h、7d、14d行MRI检查，最后一次MRI检查结束后立即处死，行病理学检查(包括光镜、电镜和免疫组化)、激光扫描共聚焦显微镜检查。 结果：①脑缺血3小时溶栓治疗后，缺血中心区和边缘区的脑血流（rNEI）较单纯缺血增高，但中心区的rMSI没有恢复，说明脑缺血3小时溶栓治疗有利于改善微循环血流灌注，而BBB已遭受破坏的脑血管，并没有因微循环血流灌注提高而通透性得到改善。脑缺血6h溶栓治疗后，缺血中心区和边缘区rNEI进一步提高，恢复至正常水平，但是中心区rTTM没有相应缩短，反而延长，中心区rMSI也没有恢复，过多的血液滞留于缺血中心组织；脑缺血9h溶栓后，缺血中心区和边缘区出现过度再灌注，中心区TTM延长至对侧的111％，MSI没有相应程度增加。提示脑缺血6h 及9h溶栓治疗，在改善缺血中心区和边缘区微循环血流灌注的同时，也促使BBB遭受严重破坏的脑微血管被动扩张，血浆蛋白和血红蛋白经过破损的BBB漏出至血管外，产生脑水肿和脑出血。脑缺血3h及6h后溶栓治疗加人体白蛋白和硫酸镁后，缺血中心区和边缘区血流量较相应时间单纯溶栓无明显改变，但缺血中心区与边缘区MSI均有明显增加，BBB的通透性得到显著改善。脑缺血9h溶栓治疗加人体白蛋白及硫酸镁后，缺血中心区血流较同一时间单纯溶栓降低，没有出现血流量过度增加表现，同时中心区rMSI上升至对侧的107％；脑缺血9h溶栓治疗加人体白蛋白后血流量仍然呈明显升高，但是其rTTM相应缩短，rMSI明显升高达127％，对比剂的廓清速度加快；②电镜结果显示B、C组脑组织损害减轻，C组脑缺血6h与9h亚组神经元核形态基本正常，线粒体轻度肿胀，星形细胞足板轻度空泡化，血管腔末见明显受压，均较A组6h亚组明显好转；③激光扫描共聚焦显微镜显示B、C组脑缺血6h与9h亚组脑梗死边缘区微血轻度扩张，有少量、局限的荧光物质渗出，较A组6h亚组均明显减少；④免疫组化GFAP显示：B、C组脑缺血6h与9h亚组，脑梗死中心区与边缘区的界限清楚，梗死边缘区GFAP增生活跃，与A组6h亚组比较增生层较厚且密集，无明显淋巴细胞增多。 结论：在人体白蛋白和硫酸镁的干预下，通过降低BBB的通透性和提高神经元、星形胶质细胞对缺血的耐受性，可减低脑缺血延迟溶栓并发症的发生率，对脑缺血超过3h 溶栓是可行的。