组织工程技术构建阴茎及尿道海绵体的实验研究

摘要

海绵体是男性阴茎和尿道的重要组成部分，男性外生殖器及尿道疾患往往伴有阴茎海绵体或尿道海绵体病变。以往多采用各种假体结合自体皮瓣重建阴茎和尿道，但海绵体组织缺失使上述手术难以兼顾形态学和功能学的效果。因此，如何重建海绵体一直是泌尿外科范畴内的一个难题。近年来，组织工程技术的发展为海绵体重建提供了可能。本研究探讨了组织工程技术重建海绵体的可行性，以期为阴茎和尿道的修复重建手术提供新的选择。全文共分三章： 第一章：种子细胞的培养 目的：探讨兔阴茎海绵体海绵体平滑肌细胞和内皮细胞的培养方法。 方法：应用胶原酶消化法和组织贴块法分离培养幼兔海绵体平滑肌细胞。差速贴壁法纯化海绵体平滑肌细胞。采用α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)和肌球蛋白重链(smMHC)免疫荧光鉴定海绵体平滑肌细胞，波形蛋白(Vimentin)衬染检测成纤维细胞。流式细胞仪检测海绵体细胞表达α-SM-actin的阳性率，比较不同培养条件下海绵体平滑肌细胞的纯度。应用0.02％的Ⅰ型胶原酶消化分离幼兔海绵体内皮细胞，以EGM-2培养液进行传代培养。采用vonWillebrand因子免疫荧光和透射电镜鉴定海绵体内皮细胞。通过流式细胞仪检测海绵体内皮细胞表达vonWillebrand因子的阳性率。 结果：体外培养的海绵体来源细胞在荧光显微镜下对α-SM-actin和smMHC仅有少量表达，随传代次数的增加，细胞表达α-SM-actin和smMHC的阳性率进一步降低。流式细胞仪检测酶消化法和贴块法原代培养的海绵体平滑肌细胞的纯度分别为16.91％、11.13％。经差速贴壁纯化后第1代海绵体平滑肌细胞的纯度分别提高到26.88％、21.98％。Vimentin免疫荧光检测到大量阳性表达。酶消化法原代培养的内皮细胞在接种后约12h开始贴壁生长，7～10d细胞可融合成铺路石状镶嵌排列，体外传代培养6～8代，细胞活力良好；免疫荧光可见内皮细胞胞浆中vonWillebrand因子呈阳性反应；透射电镜下可见胞浆中有Weibel-Palade小体。经流式细胞仪检测海绵体血管内皮细胞的纯度达93.76％。 结论：目前常规方法体外分离、培养的海绵体平滑肌细胞纯度较低，大量海绵体间质来源的成纤维细胞混杂生长，差速贴壁法可在一定范围内提高海绵体平滑肌细胞的纯度。采用0.02％的Ⅰ型胶原酶消化40～50min，以EGM-2作为培养液可在体外分离培养得到较高纯度的海绵体内皮细胞。 第二章：人脐带动脉平滑肌细胞复合海绵体脱细胞基质构建组织工程海绵体平滑肌的实验研究 目的：探讨人脐动脉平滑肌与阴茎海绵体脱细胞基质复合在裸鼠体内构建海绵体平滑肌的可行性。 方法：以1％的Triton-X100与0.1％MH3H2O制备海绵体脱细胞基质(ACCM)。异体肌肉内埋植实验评价ACCM的生物相容性。分离培养人脐动脉平滑肌细胞(HUASMCs)，MTT法测定ACCM浸提液对HUASMCs增殖的影响。将3～5代的HUASMCs接种ACCM，共培养3d、5d和10d后观察HUASMCs与ACCM复合情况。将细胞-ACCM体外复合10天后将复合物植入裸鼠背部皮下，术后10天，20天和40天分别回收移植物，进行组织学观察和器官浴槽实验评价其体内构建情况。 结果：ACCM无细胞残留，异体肌肉内埋植实验证实ACCM生物相容性良好。浸提液实验显示体外培养第4d和第6d，浸提液组OD值明显高于对照组(p＜0.05)。HUASMCs能渗入ACCM内部，并分化形成平滑肌束。自裸鼠背部皮下回收移植物，组织学观察发现随时间延长，逐渐形成结构良好的海绵体平滑肌和内皮。器官浴槽实验中，构建组织表现出与正常海绵体平滑肌类似的收缩功能；去氧肾上腺素和电刺激所诱导的最大收缩力分别为3.64±0.18g和2.50±0.21g. 结论：HUASMCs作为种子细胞与ACCM复合，可构建出具有一定形态和功能的组织工程海绵体平滑肌。 第三章：骨髓基质细胞复合PGA重建兔尿道海绵体的实验研究 目的：探讨兔自体骨髓基质细胞(BMSCs)与PGA体外复合的可行性，为尿道海绵体修复提供实验基础。 方法：制备1×1cm的非编织状PGA膜片。采用密度梯度离心法分离培养BMSCs。5ug/mlCM-Dil标记BMSCs。将BMSCs以30×106/ml与PGA体外复合培养2周。采用扫描电镜及荧光显微镜观察BMSCs与PGA的复合情况。建立新西兰大白兔尿道腹侧1cm全层尿道缺损动物模型，将PGA膜片植入尿道缺损区域，修补尿道缺损。术后1个月、2个月、3个月进行尿道造影、大体观察和组织学观察评价尿道重建情况。 结果：CM-Dil标记BMSCs阳性率达为90％以上。BMSCs与PGA复合后，BMSCs均匀密布于PGA纤维表面及PGA纤维形成的间隙中。PGA修复新西兰兔全层尿道缺损，6只动物除1只术后1个月发生尿瘘外，其余动物均排尿通畅。组织学检查发现尿道黏膜再生良好，但尿道海绵体区域主要以纤维瘢痕增生为主，未见明显尿道海绵体再生。 结论：BMSCs与PGA在体外具有良好相容性。PGA能够修复新西兰大白兔1cm尿道黏膜的缺损，但缺乏尿道海绵体再生。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

第一章种子细胞的培养

第一节兔阴茎海绵体平滑肌细胞的体外培养

第二节兔阴茎海绵体内皮细胞的体外培养与鉴定

第二章人脐带动脉平滑肌细胞复合海绵体脱细胞基质构建组织工程海绵体平滑肌的实验研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第三章骨髓基质细胞复合PGA重建尿道海绵体的实验研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

全文小结

参考文献

附录

综述一：组织工程技术阴茎功能修复重建的研究

综述二：组织工程膀胱研究新进展

综述三：海绵体神经重建治疗前列腺癌根治术后勃起功能障碍

攻读学位期间发表论文目录及获奖情况

致谢