DGCR8的类泛素化修饰及其在miRNA途径中的作用

摘要

DGCR8作为Drosha的主要结合蛋白，可以通过其C末端的两个双链RNA结合区域与pri-miRNA结合，招募并指导Drosha在pri-miRNA的正确位置剪切，生成pre-miRNA，pre-miRNA进一步被Dicer加工剪切，形成成熟的miRNA。DGCR8的缺失或异常表达会影响Drosha的剪切活性，进而影响miRNA的活性，导致疾病的发生。因此，维持DGCR8的稳定对于miRNA途径十分重要。已有文章报道DGCR8的去乙酰化修饰可以增强其与pri-miRNA的亲和力及miRNA的生成，DGCR8的磷酸化修饰可以增强DGCR8的稳定性，而Drosha可以通过对 DGCR8 mRNA的剪切使其蛋白减少。总体而言，目前对于DGCR8在经典miRNA生成过程中的作用机制已经研究得相对清楚，但对DGCR8在miRNA生成作用外的功能及DGCR8本身的调控研究仍不明确。
　　成熟miRNA作为miRNA途径的唯一效应分子已被人们普遍接受，但近期Chen CZ及Kay MA课题组相继报道pri/pre-miRNA可以识别靶基因，并直接参与介导基因沉默，为miRNA途径提出了新的作用方式。我们发现DGCR8在多个位点的SUMO1修饰可以影响DGCR8与pri-miRNA的结合，进而影响pri-miRNA介导的基因沉默作用。
　　在第一部分中，我们证实DGCR8可以发生SUMO1修饰，并被其磷酸化修饰促进。当DGCR8的主要SUMO1修饰位点K707突变为K707R之后，DGCR8蛋白的稳定性由于泛素化修饰增强而降低。同时，DGCR8-K707R会引起DGCR8与pri-miRNA的结合减少。虽然这种亲和力减弱并不影响Drosha/DGCR8微加工复合体的剪切活性及成熟miRNA的生成，却可以通过抑制pri-miRNA直接介导的基因沉默效应而影响miRNA的功能，最终减弱细胞的克隆形成能力、迁移能力及肿瘤生成。
　　在第二部分中，我们致力于寻找介导DGCR8发生SUMO1修饰的E3连接酶及DGCR8其它的SUMO1修饰位点和功能。我们发现DGCR8的SUMO1修饰可以被p14ARF促进；而位于DGCR8与p14ARF的结合区域的K259是DGCR8的另一主要SUMO1修饰位点。与DGCR8-K707R一致，K259R使DGCR8的稳定性及其与pri-miRNA的结合力减弱；但不同的是DGCR8-K259R可以使DGCR8由细胞核向细胞质分布，同时促进了细胞的克隆形成能力、迁移能力和肿瘤生成。

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第一章 绪论

1 miRNA途径

2 DGCR8研究进展

3 SUMOylation修饰

4 本研究的主要内容

第二章 DGCR8-K707位点的类泛素化修饰调控pri-miRNA直接介导的基因沉默效应

1 前言

2 材料和方法

3 实验结果

4 分析与讨论

第三章 DGCR8-K259位点的类泛素化修饰调控DGCR8的定位

1 前言

2 材料和方法

3 实验结果

4 分析与讨论

第四章 总结与展望

1 研究内容及创新点

2 展望

参考文献

攻读博士学位期间已发表或投稿的论文

攻读博士学位期间参与的科研项目

致谢