磷酸化蛋白质分析方法研究及其在人胎肝磷酸化蛋白质组研究中的应用

摘要

磷酸化修饰是生物体内最重要的蛋白质翻译后修饰之一,蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是真核细胞生命活动最普遍的调控手段.对磷酸化蛋白质的检测和磷酸化位点的确定是认识蛋白质磷酸化在生命活动中调控机制的重要参考信息,用蛋白质组学的策略研究生物体的磷酸化修饰也是功能蛋白质组学的重要研究内容.由于磷酸化蛋白质在生物体内的含量很低,对它的检测和位点分析一直是个艰难的工作,而磷酸化蛋白质的规模化分析和位点鉴定更是磷酸化蛋白质组研究面临的技术挑战.该论文的工作包括基于亲和提取和生物质谱的磷酸化蛋白质分析方法的建立,以及规模化磷酸化蛋白质分析技术在人胎肝磷酸化蛋白质组研究中的应用.论文第一章以标准磷酸化蛋白质为样本建立了蛋白质磷酸化修饰分析技术体系:以固相金属亲和色谱为基础的磷酸肽亲和富集技术帮助从复杂的肽混合物中筛选磷酸肽候选物;MALDI-TOF质谱图中的磷酸肽亚稳离子峰辅助判断丝/苏氨酸磷酸化类型;对磷酸肽候选物进行磷酸酶水解实验结合质谱分析可以直接证明磷酸肽的存在;最后用串联质谱分析结合数据库检索鉴定用来确定磷酸化位点.论文第二章搭建了全程自动化的固相金属亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱磷酸化蛋白质分析平台,程序控制,方便快捷,便于根据不同样本改变实验条件,优化分析参数.用标准磷酸肽考察了系统的性能,优化了分析参数并应用于重组人TRF1的体外磷酸化位点的鉴定,鉴定出2个磷酸化位点,为该蛋白质的激酶磷酸化修饰研究提供了有用的信息.论文第三章利用所建立的磷酸化蛋白质分析方法规模化分析了人胎肝细胞膜提取蛋白质中的磷酸化蛋白质,共鉴定出28个磷酸肽,36个磷酸化位点,分别归属于21个磷酸化蛋白质,其中有27个磷酸化位点是文献中没有报道过的.用两种磷酸化位点预测软件对鉴定出来的磷酸化蛋白质进行了位点预测,并与鉴定出的磷酸化位点进行了比较.最后对鉴定出的磷酸化蛋白质进行了亚细胞定位和功能分类分析.

目录

文摘

英文文摘

引言

第一章生物质谱结合IMAC亲和提取和磷酸酶水解分析蛋白质磷酸化修饰

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.2方法

1.2结果与讨论

1.2.1 ZipTipMC亲和提取磷酸肽

1.2.2 MALDI-TOF-MS谱中磷酸肽的亚稳离子峰

1.2.3磷酸酶去磷酸化反应

1.2.4标准磷酸肽的串联质谱分析

1.2.5讨论

1.3小结

第二章自动化IMAC-RPHPLC-MSMS在线联用分析体系的建立及应用

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与讨论

2.2.1自动化IMAC-RP HPLC-MS分析体系的建立及方法优化

2.2.2自动化IMAC-RP HPLC-MSMS分析体系在重组人TRF1体外磷酸化位点分析中的应用

2.2.3讨论

2.3小结

第三章人胎肝细胞膜提取蛋白质的磷酸化蛋白质谱分析

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与讨论

3.2.1磷酸化蛋白质的数据库检索鉴定与谱图分析

3.2.2磷酸化蛋白质的功能特性分析

3.2.3讨论

3.3小结

结语

参考文献

文献综述

攻读学位期间主要工作

致谢

本课题感谢以下基金项目的资助

附件