经典microRNA途径在雌性果蝇幼虫性腺发育中的功能研究

摘要

雌性果蝇幼虫性腺的形态建成主要依赖于体细胞和生殖细胞两大细胞谱系的协同发育，这也是成虫卵巢形成正确数目的微环境-生殖干细胞单元，即卵巢管（ovariole）所必需的。在幼虫发育早期，性腺前体细胞（somatic gonadal precursor）和原始生殖细胞（primordial germ cell）都进行增殖，其中原始生殖细胞的数目从胚胎性腺中的12个增加至三龄幼虫中期的100个左右。从三龄幼虫中期开始，体细胞谱系中的端丝细胞（terminal filament cell）开启分化模式，直到三龄幼虫晚期形成16~20垛端丝。在幼虫发育晚期，端丝和由端丝基部诱导的帽细胞形成体细胞微环境。此时，位于微环境远端的原始生殖细胞启动分化并形成生殖系胞囊。许多研究已经证明，在幼虫发育过程中，蜕皮激素（ecdysone）、胰岛素（insulin）、激活素（activin）、BMP和 EGFR信号通路所组成的调控网络协调性腺中体细胞和生殖细胞两大细胞谱系的发育。毫无疑问，研究并发现参与这一过程的更多基因或调控机制将有助于阐明该性腺发育的内在机理。
　　经典MicroRNA（miRNA）途径负责miRNA的生成及其功能行使，进而在细胞及生物学过程中起重要作用。已知该途径核心组分 Ago-1、Dcr-1、Drosha和 Pasha是果蝇卵母细胞形成和生殖细胞分裂所必须的，而Dcr-1、Loqs和Ago-1又调控了果蝇卵巢生殖干细胞的细胞命运。为探讨经典miRNA途径在雌蝇幼虫性腺发育中的可能作用及其机理，我们开展了相关基因突变遗传分析及分子检测研究。结果表明，drosha或pasha基因的功能失活突变在三龄幼虫晚期之前会导致生殖干细胞的前体细胞，即原始生殖细胞的增殖缺陷，同时促进三龄幼虫晚期原始生殖细胞的分化。进一步的研究证实，Drosha和Pasha同时以细胞自治性和细胞非自治性的方式调控原始生殖细胞的分化，而根据分子及遗传学研究推论Drosha和Pasha在原始生殖细胞分化调控上的作用至少部分涉及独立于BMP/Bam的分子机制。与此同时，Drosha或Pasha的功能丧失会扰乱性腺体细胞谱系的发育，不仅导致端丝形成缺陷，还影响早期幼虫时期端丝前体细胞的积累（增殖）。此外，我们同步检测了经典miRNA途径中其他核心因子的基因突变表型，经比较分析发现，Dcr-1、Loqs和Ago1具有类似于上述Drosha和Pasha突变系列表型，即性腺生殖细胞和体细胞谱系发育均发生缺陷。上述结果提示经典miRNA途径在幼虫性腺发育过程中具有重要的调控作用。鉴于经典miRNA途径在miRNA生成中的关键作用，本研究还对性腺发育可能涉及的功能性miRNA进行了分析鉴定。基于微阵列芯片分析的高通量筛查及遗传学分析研究发现，雌蝇幼虫性腺组织中存在一组包括 miR-8、miR-14、miR-33、miR-184、miR-317和 let-7-C在内的功能性 miRNA分子，该组 miRNA的生成受Drosha控制，miRNA基因突变可导致性腺中两大细胞谱系发育的异常。
　　综上，本研究发现经典miRNA途径在雌蝇幼虫性腺发育中起重要的调控作用，进而证实除蜕皮激素等系统性因子及BMP和EGFR信号通路外，miRNA介导的调控也参与性腺的形态建成过程。更为重要的是，本研究可望为探讨器官发育中的miRNA调控机理提供理想的工作平台。

目录

英文缩写对照表

第一章 前言

1.1 黑腹果蝇：理想的模式生物

1.2 干细胞与微环境

1.3 雌蝇幼虫性腺原始生殖细胞及其微环境

1.4 雌蝇幼虫性腺中两大细胞谱系的增殖与分化调控

1.5 经典miRNA途径及其研究背景

1.6 本论文的研究目的、内容及意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 实验结果

3.1 经典miRNA途径的核心因子Drosha和Pasha作用于雌蝇幼虫性腺的形态建成

3.2 经典miRNA途径调控雌蝇幼虫性腺的发育

第四章 讨论

4.1 miRNA途径对幼虫发育、器官生长和细胞增殖的作用

4.2 miRNA途径对雌蝇幼虫性腺体细胞发育的调控

4.3 miRNA途径对雌蝇幼虫性腺原始生殖细胞有序分化的调控

4.4 Drosha和Pasha在性腺中对生殖细胞和体细胞两大细胞谱系协同发育的作用

4.5 在幼虫性腺形态建成中一组功能性miRNA的鉴定

4.6 miRNA及其预测靶基因在幼虫性腺形态建成中的功能分析

第五章 总结与展望

5.1 全文总结

5.2 展望

参考文献

附录1 RNAi转基因果蝇品系的验证

附录2 miRNA表达水平的验证

附录3补充图表

致谢

攻读博士学位期间已发表的论文

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