营养状况对大口黑鲈生长及肝脏IGF-ImRNA表达丰度的影响

摘要

本研究以大口黑鲈为研究对象，研究了不同采样方法、不同赖氨酸添加水平以及饥饿与再投喂对大口黑鲈肝脏类胰岛素生长因子-I(IGF-I)mRNA表达的影响。开展了如下三个实验：
　　 （一）实时定量PCR采样方法学研究
　　 实时荧光定量PCR实验作为一种新兴、可靠的实验手段，针对其采样方法的研究还未见报导。肝脏作为一个功能器官其结构复杂，功能繁多，且实时荧光定量PCR实验采样量较小，因此由采样不均带来的实验误差势必会对其表达结果造成严重影响。针对此现象，本实验选用大口黑鲈(Micropter us salmoides)n成鱼（约重400g），采用局部随机采样和整体均质采样两种常用的方法进行采样，所采组织进行总RNA的提取、反转录后进行实时荧光定量PCR。实验结果显示局部随机采样的方法得出的表达丰度误差较大，相对不稳定，且波动频率较高，而整体均质采样后提取的方法相对稳定，且波动频率较低。由此得出，整体均质采样方法较为可靠，本实验后续实验均采用此采样方法。
　　 （二）禁食对大口黑鲈生长及肝组织IGF-I mRNA表达的影响
　　 生长激素/类胰素生长因子内分泌轴对鱼类的生长调节起着重要的作用，同时营养状况又对该内分泌轴产生复杂的影响。本实验运用实时定量PCR技术.研究了饥饿对l龄大口黑鲈（100±1g）生长和肝脏IGF-I mRNA表达丰度的影响。在为期6周的实验期间，对照组鱼（C组）每天表观饱食投喂2次；实验组鱼（F组）禁食3周后恢复投喂3周。实验期间对照组鱼体重和体长逐渐增加。6周后，对照组鱼体增重率为10.99％，体长增加率为3.07％。实验组禁食3周期间，鱼体重下降了5.08％、体长减少了1.79％。同时肝组织IGF-I mRNA表达水平呈下降趋势，禁食结束时仅为对照组的29.93％。恢复投喂2周后肝组织IGF-I mRNA的表达量仍显著低于对照组（P＜0.01），鱼体重为实验初始水平的96.54％，体长为对照组的99.03％，；恢复投喂3周后，实验组鱼体重、体长恢复到实验初始时水平（P＞0.05），但仍与对照组有显著差异（P＜0.01）；肝组织IGF-I mRNA的表达丰度与对照组无显著性差异（P＞0.05）。本实验结果显示，禁食使大口黑鲈体重、体长下降，同时肝组织IGF-I mRNA表达丰度也随之降低；而恢复投饲后，其生长、肝脏IGF-I mRNA的表达丰度也逐渐恢复。本研究表明，鱼类的营养状况、生长和类胰岛素生长因子-I mRNA的表达之间存有正相关关系。
　　 （三）梯度添加赖氨酸对大口黑鲈生长及IGF-I mRNA表达的影响
　　 本实验以鱼粉为主要蛋白源的饲料作为对照组(DC)，用梯度添加晶体赖氨酸的饲料作为实验组配制成8种等氮等能的饲料饲喂大口黑鲈幼鱼（平均体重32±1g），其中赖氨酸添加量(D0，D1，D2，D3，D4，D5，D6)分别为0％、0.4％、0.8％、1.2％、1.6％、2.0％、2.4％，除赖氨酸外，实验饲料的其它必需氨基酸组成模拟鱼体肌肉蛋白的氨基酸组成，生长实验经历了89天，以研究梯度添加赖氨酸对大口黑鲈生长和肝脏IGF-I mRNA表达的影响。实验结果表明，随着饲料中赖氨酸添加量的增加，大口黑鲈的增重率、特殊生长率逐渐提高，当赖氨酸添加量达到2.0％(D5)时，增重率、特殊生长率达到最大值（P＜0.05）。随赖氨酸添加量的增加，IGF-I mRNA相对表达量呈先上升后下降趋势，当赖氨酸添加量为1.6％(D4)时，IGF-I mRNA相对表达量达到最高值（P＜0.05）。本实验结果表明，补充适量晶体氨基酸对大口黑鲈的生长及IGF-I mRNA的表达丰度均有促进作用，且生长与IGF-I mRNA的表达在一定程度上呈正相关关系,但大口黑鲈肝脏IGF-I mRNA的表达还受多种因子的调控和影响。

目录

文摘

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引言

1 动物生长激素轴的概况

2 生长激素轴促进鱼类生长的作用机理

2.1 生长激素的作用机理

2.2 鱼体组织中的生长激素受体

2.3 类胰岛素生长因子的作用机理

2.4 类胰岛素生长因子结合蛋白及其受体

3 外界因子对生长激素轴的影响

3.1 营养状况对生长激素轴的影响

3.2 生长环境对生长激素轴的影响

3.3 生长激素轴与蛋白代谢

3.4 生长激素轴与脂类代谢

4 本研究的目的和意义

第一章 实时定量PCR采样方法学研究

1 实验材料

1.1 动物材料

1.2 实验试剂

1.3 实验主要化学试剂的配制

1.4 实验仪器

2 实验方法

2.1 组织取样

2.2 大口黑鲈肝脏总RNA的提取

2.3 DNase Ⅰ酶切

2.4 反转录

2.5 实时荧光定量PCR引物的设计

2.6 聚合酶链式反应(PCR)

2.7 琼脂糖凝胶电泳及割胶回收标准曲线制备

2.8 实时荧光定量PCR数据处理

3 实验结果

3.1 IGF-I、B-actin基因实时荧光定量PCR产物电泳结果

3.2 实时荧光定量PCR的标准曲线和融解曲线分析

3.3 不同采样方法对大口黑鲈肝脏IGF-I mRNA表达的影响

4 讨论

第二章 禁食对大口黑鲈生长及肝组织IGF-I mRNA表达的影响

1 实验材料

1.1 动物材料

1.2 实验饲料

1.3 试剂

2 实验方法

2.1 禁食实验

2.2 取样

2.3 RNA的提取、反转录及实时荧光定量PCR数据处理

3 实验结果

3.1 禁食对大口黑鲈生长的影响

3.2 禁食对大口黑鲈肝组织IGF-I mRNA表达的影响

4 讨论

第三章 梯度添加赖氨酸对大口黑鲈生长及IGF-I mRNA表达的影响

1 实验材料

1.1 动物材料

1.2 实验饲料

1.3 试剂

2 实验方法

2.1 养殖实验

2.2 取样

2.3 RNA的提取、反转录及实时荧光定量PCR数据处理

3 实验结果

3.1 梯度添加赖氨酸对大口黑鲈生长的影响

3.2 梯度添加赖氨酸对大口黑鲈肝组织IGF-I mRNA表达的影响

4 讨论

4.1 饲料中赖氨酸添加水平对大口黑鲈生长的影响

4.2 饲料中梯度添加赖氨酸对大口黑鲈肝组织IGF-I mRNA表达的影响

小结

参考文献

附录

致谢