鲤疱疹病毒Ⅱ型微载体培养技术与灭活疫苗浸泡免疫效果研究

摘要

鲫（Carassius auratus）是我国重要的淡水养殖品种之一，在我国水产养殖业中占有重要地位。鲫造血器官坏死症是目前危害养殖鲫最为严重的病毒性疾病，其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2）。鲫造血器官坏死症流行范围广、传染性强，死亡率高，给鲫养殖业造成了重大经济损失。目前，鲫造血器官坏死症尚缺乏有效的防控和治疗方法。疫苗免疫被认为是预防水产养殖动物传染性疾病特别是病毒性疾病最为有效的方法。鲤疱疹病毒Ⅱ型细胞疫苗制备主要以细胞瓶贴壁方式培养病毒，是疫苗规模化生产的瓶颈因素，探索鲫脑组织细胞（GiCB）与鲤疱疹病毒Ⅱ型规模化培养工艺具有潜在的应用前景。本论文针对鲤疱疹病毒Ⅱ型细胞疫苗规模化制备与应用过程中存在的关键工艺问题，开展了鲫脑组织细胞与鲤疱疹病毒Ⅱ型微载体培养技术及其灭活疫苗浸泡免疫效果的研究，旨在为鲫造血器官坏死症的有效防控提供新的技术途径。本论文主要研究内容如下：
　　1、研究了在Cephodex微载体悬浮培养系统中规模化培养鲫脑组织细胞和鲤疱疹病毒Ⅱ型的工艺。结果表明，Cephodex微载体适合GiCB细胞的贴壁培养，细胞贴壁期培养基中血清浓度为10％，微载体浓度为6g/L；细胞初始接种密度为2.5×105 cells/mL时，以转速35rpm，每静置30min搅拌2min的间歇搅拌方式贴壁率最佳，8h后贴壁率可达90%以上；增殖期以45rpm的连续搅拌速度可获得最佳的细胞生长效能。采用优化的工艺条件，以感染复数为0.2的CyHV-2病毒接种规模化培养的GiCB细胞5d后，出现典型的细胞病变效应，病毒滴度（TCID50/mL）可达106.50±0.30。本项研究为鲫造血器官坏死症疫苗的规模化制备技术奠定了前期基础。
　　2、用β-丙内酯（β-propiolactone，BPL）灭活微载体细胞培养的鲤疱疹病毒Ⅱ型制备灭活疫苗，分别用105TCID50/mL和104TCID50/mL的疫苗剂量作为免疫原浸泡免疫健康异育银鲫鱼苗（3.20±0.15cm），部分免疫鱼苗在免疫后第4周和第8周后分别进行浸泡感染攻毒实验，确定不同免疫剂量疫苗的保护效果。同时，另一部分免疫鱼苗在首次浸泡4周后同法加强免疫一次，并于二次免疫后第2、4、7、14、21和28天采集鱼体样本，利用实时荧光定量PCR检测IgM、IL-11和C3补体基因的相对表达量。攻毒感染实验后取各组的感染死鱼进行PCR病毒检测确定病原并利用TaqMan real-time PCR确定每尾鱼体的病毒载量。研究结果显示，免疫4周后免疫剂量105TCID50/mL和104TCID50/mL的相对免疫保护率分别为52%和48%，免疫8周后两种免疫剂量的相对免疫保护率分别为61.6%和53.9%，加强免疫组相对免疫保护率分别为73.1%和65.4%。加强免疫后IgM、IL-11和C3补体基因的相对表达量与对照组相比均上调。攻毒感染实验后，病死鱼PCR病毒检测均显示阳性。加强免疫组感染死鱼的病毒载量显著高于其他组（P＜0.01）。由此可见，鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）细胞培养灭活疫苗浸泡免疫异育银鲫效果较好，比较两种不同剂量免疫，免疫剂量为105 TCID50/mL时效果比104 TCID50/mL时更佳，且加强免疫一次效果更好。该结果为使用CyHV-2灭活疫苗浸泡免疫鲫鱼苗时选择合适免疫剂量提供了一定的理论依据。

目录

声明

第一章 文献综述

1鲤疱疹病毒II型研究进展

2 微载体培养技术研究进展

3 渔用疫苗的研究

4 本论文研究的目的及意义

第二章 鲫脑组织细胞与鲤疱疹病毒II型微载体规模化培养工艺研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 CyHV-2微载体细胞培养灭活疫苗浸泡免疫异育银鲫效果研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3讨论

结论

参考文献

附录一

附录二

硕士在读期间发表的学术论文

攻读硕士学位期间参加的会议：

致谢

主要试剂配制