盐度变化对中华绒螯蟹营养成分与基因表达的影响

摘要

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是国内一种重要的水产经济养殖种类。中华绒螯蟹的生殖洄游与生长洄游两个重要阶段都涉及到盐度变化，盐度变化会使其渗透压发生改变，而渗透压调节一直以来是国内外研究的热点问题。本文采用营养学、分子生物学、生物信息学等研究手段，对中华绒螯蟹在不同盐度条件下基因表达的稳定性、营养成分进行了分析以及对鳃的转录组进行了研究，探讨中华绒螯蟹渗透压调节分子机制与营养成分变化，结果如下。
　　一、不同盐度条件下中华绒螯蟹相关基因表达稳定性的研究
　　为探讨中华绒螯蟹渗透压调节过程中相关基因的表达情况，了解洄游类水生生物渗透压调节的分子基础，本文进行了中华绒螯蟹在四个不同盐度梯度下（0、10、20、30）的胁迫试验，观察了4个能量代谢相关基因：液泡ATP合成酶亚基B（vacuolar ATPsynthase subunit B,VATB）、泛素结合酶（ubiquitin-conjugatingenzyme E2b,UBE）、精氨酸激酶（arginine kinase,AK）、甘油醛-3-磷酸脱氢（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）；3个生长相关基因：泛素∕核糖体 S27融合蛋白（ubiquitin/ribosomalS27fusionprotein,S27）、β-肌动蛋白(beta-actin,β-ACTIN)、α-微管蛋白（alpha-tubulin,α-TUB）；2个应激性相关基因：热休克蛋白90（heat shock protein90,HSP90）、谷胱甘肽S-转移（glutathioneS-transferase,GST）；一个渗透压调节相关基因：钠-钾ATP酶α亚基(sodium-potassiumATPase alpha subunit,NAK)，共10个基因的表达稳定性。结果表明3个能量代谢相关基因（VATB、UBE、GAPDH）、1个应激性相关基因（GST）和渗透压调节相关基因（NAK)在不同盐度梯度间的表达量存在显著差异（P＜0.05），而其他基因的表达量不存在显著差异（P＞0.05）。应用BestKeeper、NormFinder、GeNorm三个软件进行各基因的表达稳定性分析表明，应激性相关基因（GST）和渗透压调节相关基因（NAK)对盐度变化的响应程度较高，表达不稳定；2个生长相关基因（α-TUB、S27）对盐度变化的响应程度低，表达稳定，可以作为不同盐度处理下基因表达的内参基因。本研究结果为研究中华绒螯蟹不同类别基因的表达稳定性提供了依据，为筛选盐度等环境变化条件下的内参基因提供参考依据。
　　二、盐度对中华绒螯蟹营养成分的影响
　　为探讨盐度对中华绒螯蟹营养成分的影响，本章在两个不同盐度条件下（0、20）比较了中华绒螯蟹肌肉和肝胰腺组织中脂肪酸与氨基酸的组成。结果表明，0盐度条件下的中华绒螯蟹肌肉的单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量均极显著高于20盐度（P＜0.01），盐度刺激会降低肌肉组织中不饱和脂肪酸的含量。不同盐度条件下的肝胰腺的脂肪酸含量差异不显著（P＞0.05），盐度刺激对肝胰腺中脂肪酸含量的影响较少。盐度刺激对肌肉组织中氨基酸的影响主要体现在必需氨基酸，而对非必需氨基酸影响较低，20盐度下的必需氨基酸含量显著高于（P＜0.05）0盐度。在肝胰腺氨基酸中，盐度刺激对雌蟹影响较少，而雄蟹，在20盐度条件下的必需氨基酸与非必需氨基酸均显著高于（P＜0.05）0盐度，说明盐度刺激对雄蟹氨基酸的影响较大。盐度刺激对肝胰腺和肌肉组织中氨基酸和脂肪酸的影响，说明盐度刺激能影响中华绒螯蟹的营养成分。
　　三、不同盐度条件下中华绒螯蟹鳃的转录组分析
　　中华绒螯蟹是一种洄游性经济蟹类，其一生有两次洄游，即生长洄游（溯河洄游，盐度0左右）和生殖洄游（降河洄游，盐度20左右）。本文在不同盐度条件下（0、20、0）模拟这2个洄游过程，然后利用Illumina HiseqTM4000测序技术对上述盐度条件下的中华绒螯蟹鳃组织进行了转录组进行分析。结果共获得高质量的序列92,612,226 bp条，约40Gb的测序数据。将获得的序列通过De novo拼接，共获得70,214个转录本，其中NCBI-NR数据库注释到42,188个转录本。通过基因差异表达分析，在不同盐度条件下共鉴定出783个差异表达的基因，其中在盐度条件为0条件下鉴定出91个高表达的基因；而在盐度20条件下鉴定了93个高表达基因；盐度再会0条件下鉴定62个高表达基因。在差异表达的基因中，sodium potassium-transporting atpase subunit beta-2基因参与渗透压调节过程，维持细胞的内环境；heat shock protein67b2基因使中华绒螯蟹适应盐度的变化，nadh dehydrogenase基因提供调节渗透压调节所需的能量。本实验进行不同盐度条件下中华绒螯蟹鳃的转录组数据研究，对中华绒螯蟹渗透压调节的分子机制研究提供参考。

目录

声明

引言

1论文背景

2本论文主要研究内容与技术路线：

第一章 不同盐度条件下中华绒螯蟹相关基因的表达稳定性研究

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1基因引物的PCR扩增率

2.2基因的相对表达量（qRT-PCR分析）

2.3基因的表达稳定性分析

3讨论

第二章 盐度对中华绒螯蟹营养成分的影响

1实验材料与方法

1.1脂肪酸组成测定

1.2氨基酸的测定

1.3数据处理

2结果与分析

2.1脂肪酸的比较分析

2.2氨基酸的比较分析

3讨论

第三章 不同盐度条件下中华绒螯蟹鳃的转录组分析

1材料与方法

1.1实验材料

1.2组织总RNA的提取

1.3cDNA文库的构建和测序

1.4原始数据的过滤与转录组拼接

1.5转录组的注释

2结果与分析

2.1中华绒螯蟹鳃RNA-seq测序数据统计

2.2转录组从头测序数据的组装

2.3 序列的同源性比对

2.4转录本的GO功能注释聚类

2.5差异表达分析

3讨论

小结

一、主要结果：

二、展望：

参考文献

硕士期间科研成果及获奖情况

致谢