生物芯片和RNA干扰技术在肝癌和法医学研究中的应用

摘要

人类肝细胞癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,目前,对大多数肝癌病人来说还没有非常有效的治疗方法,所以急需鉴别和验证肝癌中的一些新的抗癌靶点。人们普遍认同,cDNA芯片、组织芯片及RNA干扰是研究中鉴别和验证疾病相关生物标记物的非常有用的工具。
　　这个研究的目的是鉴别和验证肝癌相关的新的诊断靶点和治疗靶点。
　　我们用12800点的cDNA芯片分析了肝癌的基因表达谱,不仅分析了33例肝癌和相对应的癌旁组织的表达谱,而且分析了25例肝癌和正常肝组织的表达谱。针对与肝癌发生发展相关的差异表达基因进行功能分析表明:上调表达的基因主要与细胞周期相关,而下调表达的基因主要与免疫反应相关。我们利用基因表达谱的数据,检测出了2个染色体畸变区域只存在于低分化肝癌中。我们鉴别出了在至少50％以上的肝癌样本中发生显著上调表达的2种新的人蛋白基因及另外20种在诊断肝癌方面有新用途的人蛋白基因,这些基因及其编码的蛋白多肽可以用于肝癌的检测,作为肝癌诊断的肿瘤标志物等用途。我们鉴别出了一个包括9个基因的判别式,它既可以预测肝癌样本的分化程度,还可以预测肝癌病人术后生存情况,其准确率优于以临床和组织病理标准为基础的传统方法。在这9个最具判别力的基因中,MCM2和CCNB1是与细胞周期通路相关的两个发生显着上调表达的基因,我们选择它们做进一步的研究。
　　我们用以组织芯片为基础的免疫组化的方法验证了MCM2蛋白在肝癌中与分化程度相关的上调表达情况,组织芯片上包括99例肝癌、23例肝硬化及24例正常肝组织。
　　我们用RNA干扰的方法特异性的抑制了肝癌细胞(SMMC-7721andQGY-7703)中MCM2或/和CCNB1的上调表达。单独干扰引起的MCM2或CCNB1的表达缺失能够导致肝癌细胞的G2/M期的细胞周期阻滞、细胞凋亡及细胞增殖受阻,而共同干扰两个基因则能够增强这些作用。另外,我们发现在肝癌细胞中,MCM2或/和CCNB1特异性缺失后,某些细胞周期生物学通路中的其他上调表达的基因也发生了下调表达,这些基因有可能是MCM2或/和CCNB1的下游基因。
　　我们还利用寡核苷酸芯片技术并行检测了24例肝癌及其相对的癌旁组织的样本中p53基因7个常见突变位点。在肝癌组织中,p53基因突变13例,突变率为54.2％,突变样本共存在3个位点(密码子)4种点突变形式,以249密码子突变为主,主要为249Arg-＞Ser。突变;在癌旁组织中,均未检测到p53基因突变。寡核苷酸芯片检测结果经过DNA测序法验证,两项技术检测结果完全吻合。实验表明,应用寡核苷酸芯片技术能够并行、高效、多位点检测肿瘤的基因突变。
　　我们系统的结合基因芯片、组织芯片及RNA干扰分析来鉴别和验证了与肝癌的发生发展相关的一些新的生物学标记物。我们鉴别出了一个能够预测肝癌样本分化程度及术后生存情况的9基因判别式。我们的研究同时表明,MCM2和CCNB1是与肝癌的发生发展相关的潜在的生物学标记物,它们有希望成为肝癌治疗的分子靶点。我们的研究有助于进一步阐明肝癌的分子机制,为鉴别新的治疗靶点提供线索。
　　此外,我们开发出了适用于我国人群的SNP芯片,能够检测45个SNP位点,个体识别率达到10-9,灵敏度与当前STR的基因型检测技术相当,成果可望应用于各个法医物证学鉴定机构(亲子鉴定和个体识别),使法医DNA分析技术进入一个新的领域。