阿尔茨海默病的放射性诊断药物[11C]6-OH-BTA-1标记及其在正电子发射断层扫描中显像方法的建立

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的确诊,需要在特定脑区中发现广泛存在含有大量β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)的老年斑(Senile Plaques,SPs)、神经纤维缠结(Neurofibrillary Tangles,NFTs)及神经元细胞坏死。现已发现,在部分有轻微认知功能下降,但尚未达到AD的临床诊断标准,即轻微认知损害(mild cognitive impairment,MCI)的人脑中有典型的AD样的病理改变。而近半数的MCI人群,在数年后会发展为AD,症状出现后给予的药物治疗只能减慢但不能逆转认知损害的程度。如能在早期用无创的方法检测出活体脑中AD特异性的病理物质Aβ或NFTs,就可以达到早期诊断AD,延缓疾病进程,最终实现预测和有效治疗AD的目的。
　　 在活体脑中尽早发现AD特异性的病理物质Aβ或NFTs是早期诊断AD的关键。近年来,针对这类病理物质特别是Aβ聚合物的脑PET显像的研究越来越成熟。特异性Aβ示踪剂的寻找和效果检验是PET诊断技术的关键,有部分示踪剂已经进行了活体内的临床应用研究,显示出良好的诊断特性。本课题从Aβ示踪剂[11C]6-OH-BTA-1的前期化学合成开始,摸索出合适的放射性标记条件,建立质控标准,完成了[11C]6-OH-BTA-1在动物体内的药代动力学等一系列临床前期研究,为药物进入临床试验做好准备。
　　 第一部分脑β-淀粉样蛋白的PET显像药物[11C]6-OH-BTA-1的化学前体6-OH-BTA-0和质控用标准品6-OH-BTA-1的合成、鉴定
　　 目的:PET显像药物[11C]6-OH-BTA-1(靶点为β-淀粉样蛋白)的化学前体6-OHH-BTA-0和质控用标准品6-OH-BTA-1的合成和鉴定,并摸索出合适的高效液相分离条件。
　　 方法:1.通过有机化学合成,将原料N-(4'-甲氧苯基)-4-硝基苯甲酰胺依次生成中间体①N-(4'-甲氧苯基)-4-硝基硫代苯甲酰胺,中间体②2-(4'-硝基苯基)-6-甲氧基苯并噻唑,中间体③2-(4'-硝基苯基)-6-羟基苯并噻唑,中间体④2-(4'-硝基苯基)-6-甲氧基甲氧基苯并噻唑,至中间体⑤2-(4'-氨基苯基)-6-甲氧基甲氧基苯并噻唑(6-MOMO-BTA-0)。
　　 2.PET显像药物[11C]6-OH-BTA-1(靶点为β-淀粉样蛋白)的化学前体2-(4'-氨基苯基)-6-羟基苯并噻唑(6-OH-BTA-0)和质控用标准品2-[4'-(甲氨基)苯基]-6-羟基苯并噻唑(6-OH-BTA-1)均是通过中间体⑤6-MOMO-BTA-0反应而成。
　　 3.调整流动相中各组成成分比例,将6-OH-BTA-0和6-OH-BTA-1分开。
　　 结果:1.合成的6-OH-BTA-0呈淡黄色固体状,化学结构经中国科学院有机化学研究所核磁确证。
　　 2.合成的6-OH-BTA-1呈朱红色固体状,化学结构经中国科学院有机化学研究所核磁确证。
　　 3.分析型HPLC检测系统:反相HypersilC-18固相分离柱(ODS25um,4.6mm×250mm),流动相条件V(乙腈):V(水):V(三乙胺):V(乙酸)=250:250:1:4,PH=6,流速2ml/min,紫外光254nm处检测。
　　 第二部分PET显像药物[11C]6-OH-BTA-1的放射性标记方法
　　 目的:1.比较现有的两种放射性标记[11C]6-OH-BTA-1方法:“反应瓶”法和“loop环”法的优劣。
　　 2.比较自制6-OH-BTA-0和德国ABX公司制6-OH-BTA-0的标记效果。
　　 方法:1.使用11C-Triflate-CH3进行自制6-OH-BTA-0的11C同位素标记,采用“反应瓶”法和“loop环”法两种制备方法合成[11C]6-OH-BTA-1,应用C18cartridge柱提纯产品。
　　 2.分别使用两种来源的6-OH-BTA-0,使用“loop环”法,通过11C-Triflate-CH3同位素标记成[11C]6-OH-BTA-1,应用C18cartridge柱提纯产品。
　　 结果:1.两种方法从加速器开始生产11COx到合成出[11C]6-OH-BTA-1的时间相差1分钟,未校正11C衰变的情况下,按照加速器生产925MBq11C-Triflate-CH3计算,[11C]6-OH-BTA-1的“反应瓶”法产率为28±12％,而“loop环”法产率为40±4％。
　　 2.自制6-OH-BTA-0和ABX公司6-OH-BTA-0标记后的放化纯分别为92-93％和93％,放化产率也在40±4％同等范围内,未见两者有明显差异。且自制6-OH-BTA-0反复标记8次的结果,均在有效波动范围。
　　 第三部分[11C]6-OH-BTA-1进入人体实验的临床前准备
　　 目的:1.制定出[11C]6-OH-BTA-1静脉制剂的质控标准。
　　 2.完成小鼠急性毒性试验。
　　 3.研究[11C]6-OH-BTA-1在动物体内的药物吸收、分布和清除,寻找合适的PET/CT图像处理方法。
　　 方法:1.参考国家发行的《正电子类放射性药品质量控制指导原则》制定了本品的质量标准。根据规范合成了3批[11C]6-OH-BTA-1注射液成品,常温下在3个半衰期(60分钟)内对放化纯度做跟踪检测的稳定性试验。
　　 2.每千克小鼠注射人1000倍量的[11C]6-OH-BTA-1,观察1周,称重并处死、解剖,取主要器官做病理检查。
　　 3.正常大鼠注射[11C]6-OH-BTA-1后,不同时间点(每个时间点为一组),断头放血处死。分别取血和心、肝、脾、肺、肾、脑(额叶、颞顶叶、枕叶、小脑和脑干)脏器,置入16探头的放射免疫计数器内测定放射性计数并称重,计算经体重校正后每个时间点的每克组织注射剂量百分数％ID-Kg/g。小鼠和猕猴静脉注射[11C]6-OH-BTA-1后一定时间,使用SIMENSE Biograph 64 PET/CT扫描。使用True D程序中的3D自动勾画出在脑区、心区、肝区、脾区、肺区、肾区和膀胱区的容积感兴趣区(VOI),获得各脏器和全身的放射性计数(Bq),计算各脏器放射量占全身总放射量的比例(％ID)。
　　 结果:1.[11C]6-OH-BTA-1静脉注射液呈无色透明、无沉淀(铅玻璃后目测),pH值:6.0～8.0(pH试纸),放射性核纯度:21±0.5min(采用半衰期计算法),放化纯度:＞90％(放化纯检测方法:HPLC法),无菌无热原符合规定要求。
　　 2.毒性试验中主要器官(脑、心、肝、脾、肺和肾)病理切片检查均无异常。
　　 3.正常大鼠注射[11C]6-OH-BTA-1后,血和肺放射性早期摄取较多,但清除迅速,主要通过肝脏代谢。注射后20min时的[11C]6-OH-BTA-1在除脑外其余的器官内放射性分布从高到低如下:肝、肺、肾、血、脾、心。痴呆组心脏分布％ID=0.63±0.14和脾脏％ID=0.17±0.11高于老龄对照小鼠心脏的0.42±0.12和脾脏0.07±0.02,且p＜0.05,有统计学差异。其余脏器均未见两组老鼠间有统计学差异。认为[11C]6-OH-BTA-1在PDAPP717I转基因型痴呆小鼠脑内结合同正常对照的老龄小鼠类似。
　　 结论：
　　 1.自制6-OH-BTA-0和6-OH-BTA-1经核磁确证化学结构。
　　 2.通过研究,“loop环”法是最佳的[11C]6-OH-BTA-1标记方法。
　　 3.[11C]6-OH-BTA-1通过小鼠急性毒性试验。
　　 4.大鼠体内分布和猕猴PET显像证明,[11C]6-OH-BTA-1在体内约20min时达到稳态,此时是AβPET的最佳显像时间。
　　 5.[11C]6-OH-BTA-1在PDAPP717I转基因型痴呆小鼠脑内结合同正常对照的老龄BALB/c小鼠无差异。
　　 该系列实验完成了[11C]6-OH-BTA-1PET诊断AD的临床应用前准备。