抗多囊蛋白-1单克隆抗体和多克隆抗体的制备及其在常染色体显性遗传性多囊肾病发病机理研究中的应用

摘要

探讨体液中多囊蛋白-1的定量检测在临床ADPKD诊治中的应用价值.该研究由三部分组成.一、多囊蛋白-1胞外区的重组表达及纯化.提取健康人肾组织总RNA，根据已知的PKD1cDNA序列（GenBankL33243），自行设计2对引物跨越多囊蛋白-1成熟蛋白的氨基端部分LRR区和部分WSC区.用一步法RT-PCR选择扩增编码多囊蛋白-1这一多拷贝区的两个cDNA片段（其大小分别为502bp和471bp），并将之克隆到融合蛋白表达载体pQE30中，构建的表达载体pQE30-PKD1e1和pQE30-PKD1e2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实为所需要的质粒后，将其转染含有阻遏质粒pREP4的大肠杆菌M15.异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达氨基端有6个连续组氨酸的融合蛋白，用Ni-NTA Agarose行亲和层析纯化融合蛋白.纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示出相对分子质量分别为19.8kD、18.9kD的融合蛋白，经Western blot鉴定为多囊蛋白-1的融合蛋白.这2段多囊蛋白-1氨基端的融合蛋白都可用于免疫动物，制备抗多囊蛋白-1氨基端的融合蛋白都可用于免疫动物，制备抗多囊蛋白-1胞外区氨基端的抗体.二、抗多囊蛋白-1单克隆抗体和多克隆抗体的制备.将纯化好的分子量18.9kD的多囊蛋白-1的融合蛋白皮下免疫Balb/C小鼠和新西兰大白兔，分别制备抗多囊蛋白-1的单克隆抗体和多克隆抗体.三、多囊蛋白-1的组织细胞学定位和体液中多囊蛋白-1胞外段的定量检测.1.多囊蛋白-1在肾组织和细胞中的表达研究.2.体液中多囊蛋白-1胞外段的定量检测.Qian等人最近提出多囊蛋白-1在G蛋白偶联受体的蛋白分解位点（多囊蛋白-1的GPS区）发生剪切，GPS区的蛋白分解剪切功能可能与多囊蛋白-1在肾脏中的正常功能有关.按照这种理论，多囊蛋白-1虽不是分泌蛋白，但在体液中应该能检测到多囊蛋白-1的胞外区部分，而且正常人体液中的多囊蛋白-1含量将高于ADPKD病人.由于体液中多囊蛋白-1的含量在ADPKD病人和正常人之间有显著差异，我们在设法探讨其发生机制的同时，正在考虑将实验条件、标本处置及夹心ELISA方法技术进一步优化，将这一国内外首先的发现应用于ADPKD的临床诊断和鉴别诊断，这将具有非常现实的临床意义，可为临床提供一种简单、方便、敏感和特异的诊断多囊肾病的理想方法.

目录

缩略词表

前 言

第一部分 多囊蛋白-1胞外区的重组表达及纯化

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分 抗多囊蛋白-1单克隆抗体和多克隆抗体的制备

材料与方法

结 果

讨 论

第三部分 多囊蛋白-1在组织和细胞中的表达研究及体液中多囊蛋白-1的定量检测

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

致 谢

综述

1.ADPKD的遗传学

2.ADPKD是一个灶性疾病

3.多囊蛋白

3.1多囊蛋白-1

3.2多囊蛋白-2

3.3多囊蛋白与纤毛

3.4多囊蛋白的信号传导

4.结论

参考文献

在读期间发表文章

附录1：人PKD1 cDNA序列

附录2：人多囊蛋白-1氨基酸序列