心理应激大鼠肝脏SFXN1的表达变化及其对肝细胞铁代谢相关分子的影响

摘要

研究背景:
　　 铁是机体含量最丰富的金属元素之一，含铁蛋白在体内发挥重要的生理功能，参与氧的转运，细胞呼吸、物质代谢、转录调节和DNA修复。机体铁缺乏会产生缺铁性贫血和多种代谢障碍，然而过量的铁在体内能通过Fenton反应引起脂质过氧化，进一步损伤蛋白质和（或）核酸。机体铁负荷与癌症、冠心病、帕金森病、糖尿病等多种疾病的发生有关。肝脏是机体储存铁的主要器官，也是铁过量损伤的主要器官，有大量研究资料证实，肝铁过负荷会导致肝细胞坏死，纤维化和肝肿瘤，还能引起胰岛素抵抗、增加胆固醇的合成和沉积。因此探讨铁过负荷的原因，寻找防治的潜在靶点成为医学研究的热点。目前已证实HFE、HJV、TfR2等基因突变导致遗传性血色素沉着病，反复输血、膳食铁摄入过多等因素都可以引起机体铁过负荷，但是对于大多数疾病存在铁过负荷的原因尚未完全阐明。
　　 心理应激是指机体对外界有害物、威胁、挑战经认识评价后，知其将危害个人的生存和地位时，所产生的生理、心理和行为反应。现代生活中，人们在生活和工作中承受的负荷日益加大，精神紧张或心理负担过重己成为常见的应激源，对人体健康的影响正越来越受到人们的重视。课题组前期的研究发现，心理应激可引起实验动物肝铁蓄积。其中部分原因可能是通过IL-6上调hepcidin及糖皮质激素对IRP1的调节，由于心理应激动物肝铁蓄积十分明显，是否还有其它的因素导致肝铁蓄积有待于深入研究。
　　 为了进一步分析心理应激导致肝铁蓄积的可能原因，本研究采用基因芯片技术筛选心理应激大鼠肝脏的差异表达基因，并根据基因表达趋势分析与肝铁负荷变化趋势相一致的基因，寻找与肝铁代谢变化有关的分子。结果发现在心理应激情况下，hepcidin、TfR1等已知的与铁代谢有关的分子发生了变化，还发现SFXN1的表达增强。SFXN1也称为三羧基携带蛋白TCC，是sideroflexin家族成员之一，定位于线粒体膜上，是真核生物的一种进化保守蛋白。有研究资料表明，SFXN1可能具有转运有利于铁利用的某种成分进入线粒体的功能，flexed-tail小鼠SFXN1发生了移码突变，表现出红细胞线粒体内铁沉积的特征。线粒体是细胞电子传递和能量代谢最为旺盛的细胞器，线粒体内铁代谢紊乱会严重地影响到整个细胞的铁代谢。因此，SFXN1是否对细胞铁代谢相关分子产生一定的影响，从而参与心理应激反应肝铁负荷的发生，我们进行了进一步实验研究。
　　 研究目的:
　　 利用基因芯片筛选心理应激情况下大鼠肝脏的差异表达基因，并在此基础上寻找可能参与心理应激铁代谢异常的基因，为阐明心理应激导致肝铁负荷提供新的研究思路。
　　 研究方法:
　　 一、心理应激大鼠血清铁和肝铁含量变化
　　 1、实验动物分组
　　 健康雄性SD大鼠48只（体重120±10g），购自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司。按体重随机分为对照组、1天、3天、7天心理应激组4组，每组8只，其余作为电击组。动物饲养实验室环境温度24℃±1℃，湿度50％～60％，自由饮食，光照自然昼夜节律变化。
　　 2、心理应激模型制作
　　 采用Communication box system制作大鼠心理应激模型。Communication boxsystem由透明丙烯酸板制成，一半小室铺绝缘板（A室），另一半小室不铺绝缘板(B室)。B室的大鼠每天接受30分钟80V电压的足底电击，电击后跳跃、尖叫;在A室的大鼠通过视觉和听觉产生恐惧的心理应激。
　　 3、血清CORT、ACTH及NE测定
　　 血清CORT、ACTH及NE测定按检测试剂盒说明进行操作。
　　 4、肝铁、血清铁含量的测定
　　 湿法消化肝组织，原子吸收分光光度计火焰法测定肝铁和血清铁含量。
　　 5、血清转铁蛋白饱和度的测定
　　 采用血清铁和血清总铁结合力试剂盒测定。
　　 二、心理应激大鼠肝脏SFXN1及铁代谢相关分子的变化
　　 1、实验动物分组及处理
　　 实验动物分组及处理同第一部分。每组选三只大鼠进行基因芯片分析。
　　 2、基因芯片分析
　　 采用Affymetrix公司的Rat Exon1.0 ST Array全转录组表达谱芯片，利用随机方差模型(RVM)，以P＜0.05和FDR＜0.05为判断标准，进行差异基因筛选。用GO分类法查找与铁代谢有关的基因，并根据基因表达趋势分析与肝铁负荷变化趋势相一致的基因。
　　 3、大鼠肝脏hepcidin、 TfR1、sfxn1 mRNA表达的变化
　　 采用实时荧光定量PCR法测定大鼠肝脏内铁调素(hepcidin)、转铁蛋白受体1（transferrin receptor1，TfR1）、sideroflexin1(sfxn1)的mRNA表达水平。
　　 4、大鼠肝脏hepcidin、 TfR1、sfxn1蛋白含量的测定
　　 采用Western blot法测定各组大鼠肝脏hepcidin、TfR1、sfxn1的蛋白含量。
　　 三、 SFXN1对肝细胞铁代谢主要调节分子的影响
　　 1、细胞培养
　　 HepG2肝细胞株，含10％胎牛血清的DMEM培养液37℃、5％CO2培养。
　　 2、Sfxn1 siRNA转染细胞
　　 按说明书将sfxn1 siRNA转染HepG2细胞后，培养箱中培养48h。
　　 3、肝细胞sfxn1、TfR1、hepcidin、 IRP1、IRP2 mRNA测定
　　 采用实时荧光定量PCR法测定HepG2细胞sfxn1、TfR1、hepcidin、IRP1、IRP2mRNA的表达水平。
　　 4、肝细胞sfxn1、TfR1、hepcidin、 IRP1、IRP2的蛋白测定
　　 采用Western blot法测定HepG2细胞sfxn1、TfR1、hepcidin、IRP1、IRP2的蛋白含量。
　　 四、数据的统计与处理
　　 采用SPSS16.0统计软件包对实验数据进行统计分析。两组间比较采用两独立样本t-检验;多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时各组样本均数间两两比较采用LSD-t检验，各实验组间与对照组比较采用Dunnett法。方差不齐时采用Dunnett's C检验。实验数据以平均数±标准差（(x)±s）表示，p＜0.05认为有统计学意义。
　　 结果:
　　 一、心理应激大鼠血清铁和肝铁含量变化
　　 1、心理应激大鼠血清CORT、ACTH与NE含量变化
　　 心理应激大鼠血清CORT、ACTH、NE含量较对照组明显升高，说明心理应激模型成功制作。
　　 2、心理应激大鼠肝脏铁含量变化
　　 随着应激时间的延长，大鼠肝组织铁含量逐渐升高，7天心理应激组大鼠肝脏铁含量与对照组比较上升了53.02％(P＜0.05)。1天和3天心理应激组大鼠肝铁含量与对照组比较无统计学意义(P＞0.05)
　　 3、心理应激大鼠血清铁含量变化
　　 1天和3天心理应激组大鼠血清铁含量与对照组比较无统计学意义(P＞0.05)，7天心理应激组大鼠血清铁含量与对照组比较下降了29.21％，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4、心理应激大鼠血清转铁蛋白饱和度的变化
　　 7天心理应激组大鼠血清转铁蛋白饱和度与对照组比较下降幅度达到32.2％(P＜0.05);1天和3天心理应激组大鼠血清转铁蛋白饱和度较对照组分别下降了7.87％、19.85％，无统计学意义(P＞0.05)。
　　 二、心理应激大鼠肝脏SFXN1及铁代谢相关分子的变化
　　 1、基因芯片筛选心理应激大鼠肝脏铁代谢相关差异基因
　　 在心理应激过程中，大鼠肝脏基因mRNA转录水平有明显差异的为2246个。对这些差异表达基因进行生物信息学分析，与铁代谢有关的差异基因有七个，分别为Hamp、Tfrc、sfxn1、GDF2、IREB2、NUBP1、NUBP2。sfxn1基因的表达趋势分析显示其变化趋势与肝铁沉积变化趋势一致。
　　 2、心理应激大鼠肝脏hepcidin、 TfR1 mRNA的表达变化
　　 7天心理应激后大鼠肝脏hepcidin mRNA的表达水平较对照、1天、3天心理应激组均有显著升高(P＜0.01);心理应激第七天TfR1 mRNA的表达水平比对照、1天、3天心理应激组升高，并有统计学意义。
　　 3、心理应激大鼠肝脏hepcidin、 TfR1的蛋白表达变化
　　 7天心理应激组hepcidin蛋白的表达水平较对照、1天、3天心理应激组均有显著升高(P＜0.01)。TfR1蛋白在应激后逐渐升高，7天心理应激组TfR1蛋白的表达水平与对照组比较有统计学意义(P＜0.01)。
　　 4、心理应激大鼠肝脏sfxn1的表达变化
　　 应激后sfxn1 mRNA的水平逐渐升高，3天应激组与对照组、1天应激组比较有统计学意义(P＜0.01);7天应激组sfxn1 mRNA的表达水平比对照、1天、3天心理应激组升高，并有统计学意义(P＜0.01)。
　　 Sfxn1蛋白在应激后逐渐升高，7天心理应激组的表达水平较对照组升高66％(P＜0.01)。
　　 三、SFXN1对肝细胞铁代谢主要调节分子的影响
　　 1、Sfxn1 siRNA转染对HepG2细胞sfxn1 mRNA表达的影响
　　 HepG2细胞转染sfxn1 siRNA后sfxn1 mRNA的表达量较未转染的对照组降低(P＜0.05)。
　　 2、Sfxn1 siRNA转染对HepG2细胞TfR1、hepcidin mRNA表达的影响
　　 Sfxn1 siRNA转染HepG2细胞48小时后，转染组TfR1 mRNA的表达量较未转染组降低了78％(P＜0.01)。Hepcidin mRNA的表达量与对照组比较无区别。
　　 3、Sfxn1 siRNA转染对HepG2细胞IRP1、IRP2 mRNA表达的影响
　　 Sfxn1 siRNA转染HepG2细胞48小时后，转染组IRP1 mRNA的表达量较未转染组降低了80％(P＜0.05)。转染组IRP2 mRNA的表达量与对照组比较无差别。
　　 4、Sfxn1 siRNA转染降低HepG2细胞sfxn1蛋白表达
　　 Sfxn1 siRNA转染HepG2细胞后使sfxn1蛋白表达下降(P＜0.01)。
　　 5、Sfxn1 siRNA干扰对HepG2细胞TfR1、hepcidin蛋白表达的影响
　　 Sfxn1 siRNA转染HepG2细胞后使TfR1蛋白表达下降(P＜0.01)。hepcidin的蛋白表达不受影响。
　　 6、Sfxn1 siRNA干扰对HepG2细胞IRP1、IRP2蛋白表达的影响
　　 Sfxn1 siRNA转染HepG2细胞后使IRP1蛋白表达下降(P＜0.01)。IRP2的表达未发生改变。
　　 结论
　　 1.连续7天心理应激可以引起大鼠肝铁蓄积。
　　 2.基因芯片发现心理应激过程中Hamp、Tfrc、sfxn1、GDF2、IREB2、NUBP1、NUBP2共7个与铁代谢相关的基因发生了改变。hepcidin、TfR1、sfxn1的mRNA和蛋白水平随着应激天数的增加不断上升。
　　 3.sfxn1能影响TfR1的表达
　　 综上所述，心理应激时可能通过sfxn1引起转铁蛋白受体1表达增加，肝细胞摄入铁增加，导致肝铁蓄积。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词表

前言

第一部分 心理应激大鼠血清铁和肝铁含量变化

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二部分 心理应激大鼠肝脏SFXN1及铁代谢相关分子的变化

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三部分 SFXN1对肝细胞铁代谢主要调节分子的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文总结

综述

在读期间发表论文情况

致谢