Mcrolactin生物合成基因簇序列与功能分析

摘要

聚酮合酶(polyketide synthase)是催化产生多种类型的聚酮化合物及其复杂的衍生物的关键酶，其中部分化合物具有重要的药理学活性。分离、鉴定与异源表达这些合成生物活性化合物的新PKS，成为生物技术药物研究领域的重点。
　　 本研究提取了中国东海的一株解淀粉芽孢杆菌F201721的基因组DNA，构建了它的细菌人工染色体文库（BAC文库），通过设计简并引物，拼接扩增出PKS基因簇的编码序列共计531835bp。通过数据库和生物信息学软件对基因组进行了解析:它是一个基因簇，编码9个模块，负责编码41个与聚酮合成相关的酶。与陆地来源的解淀粉芽孢杆菌FZB42中PKS相比，海洋来源的PKS在启动子位置附近缺少了25个碱基。通过软件预测推测，这25个碱基可能调控PKS的表达。通过EMSA分析，发现有特异性的蛋白与这25个碱基结合，蛋白分子量约为35KD。结合抑菌实验发现，这个与启动子特异性结合的蛋白表达发生在细菌对数生长期，也就是说，这个蛋白对于PKS的表达是有抑制作用的。
　　 在这两株菌中，蛋白在对数生长期与含有25个碱基的启动子序列是有结合的，抑菌圈直径是2cm:在对数生长期后期，FZB42中有蛋白和含有缺失碱基的启动子序列结合，但是在F201721中未发现蛋白可以与之结合，结合抑菌圈实验，在细菌生长稳定期后期，FZB42中的抑菌圈明显比F201721的大，表明这个蛋白可以抑制PKS的表达，在对数期后期，特异性蛋白从启动子序列上A脱落，启动了PKS的表达，使得FZB42中macrolactins的产量大于F201721的macrolactins的产量，表现为FZB42中抑菌圈大于F201721中的抑菌圈。验证了缺失的25个碱基在macrolactins表达方面起调控作用，也说明了这两株菌中，PKS的表达机制是有差异的。
　　 一、构建F201721的细菌人工染色体文库
　　 这株来自中国东海的芽孢杆菌F201721是本室保存的。通过低熔点琼脂糖法抽取细菌基因组DNA，获得的基因组DNA分子量在200kb，再用BamHⅠ酶切10min，获得平均长度为100kb的片段，电洗脱去盐去离子以后，使用Epicentre试剂盒构建BAC文库，通过蓝白斑筛选获得含有合适片段大小的阳性克隆，通过BAC末端测序，期望获得含有PKS编码序列的阳性克隆，经blastn分析发现，筛选得到的阳性克隆都不含完整的macrolactins编码序列，不能直接用于异源表达。
　　 二、获得的PKS编码序列并对其进行序列和功能分析
　　 根据已经全基因组测序的FZB42上PKS编码序列中，通过NCBI的Conserved Domains Database找出保守区域并适合设计引物14对，每对引物上下游间隔为6kb-10kb，退火温度在65℃-73℃之间，上下游引物的退火温度相差不超过5℃，引物长度为25bp，通过使用TaKaRa公司的Lataq酶进行长链PCR扩增，PCR模板为含有PKS编码序列的阳性克隆中的BAC重组子，PCR产物做胶回收以后送Invitrogen（英骏）进行序列测定，通过片段拼接得到了macrolactins生物合成基因簇的编码序列，全长531835bp，经NCBI数据库序列以及功能分析，我们得到了F201721的PKS基因簇编码序列，共有9个模块，含有负责聚酮合成的41个酶，发现这些序列与FZB42中的核苷酸序列高度同源，最低的相似度是97％，最高的达到100％。氨基酸相似度最高为99％，氨基酸最低为96％。在分析序列时，我们注意到，与陆地来源的解淀粉芽孢杆菌相比，海洋来源的解淀粉芽孢杆菌F201721中PKS编码序列前面的启动子区域缺少了25个碱基，通过网上不同类型的promoter predict软件分析发现，缺失的25个碱基在PKS编码序列上游启动子位置，指示在PKS表达调控上起作用。
　　 三、验证两株菌中聚酮合酶基因簇由于序列差异引起的表达调控差异
　　 使用不同的类型的promoter predict软件分析，预测显示缺失片段位于启动子区域。由于在枯草芽孢杆菌中，次级代谢产物的调控通常是通过转换不同的σ因子来调控的，我们预测该缺失片段可能通过结合特定蛋白调控macrolactins表达。通过蛋白迁移率实验，发现有蛋白在细菌对数生长期到稳定期前可以与这段DNA结合。随着细菌生长进入平台期，FZB42中特异结合该序列的蛋白消失了，而细菌的抑菌圈明显增大，说明与缺失片段结合的蛋白调控了Macrolactins的表达，使得Macrolactins的产量在稳定期后期明显增加。也侧面验证了编码序列确实可以合成大环内酯类24元环的聚酮类化合物Macrolactins。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 构建海洋来源的枯草芽孢杆菌F201721基因组BAC文库

(一)材料和方法

(二)结果

(三)讨论

第二部分 Macrolactins生物合成基因簇的克隆和生物信息学分析

(一)实验方法

(二)实验步骤

(三)实验结果

(四)讨论

第三部分 陆地来源与海洋来源聚酮合酶调控序列差异

(一)实验方法

(二)实验步骤

(三)结果

(四)讨论

小结

文献综述 聚酮合酶研究进展

参考文献

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢