三疣梭子蟹线粒体DNA多态性研究

摘要

本实验通过对分布在中国海沿岸的三疣梭子蟹种群(样品分别来自丹东、营口、莱州、青岛、连云港、宁波、北海)七个野生种群线粒体DNA 16S rRNA Cytb和D-Loop片段的测序来研究中国沿海各大海区三疣梭子蟹的遗传结构和遗传变异，以期为三疣梭子蟹遗传资源的保护提供一定的理论依据。 高盐法提取基因组DNA，使用引物设计软件Premier Primer5.0设计并筛选两对引物分别扩增mtDNA Cytb基因和D-Loop序列，16SrRNA引物为通用引物，并进行序列测定。将测序结果用Clustal X 1.83软件排序，用MEGA3.1(Kumar et al.1994)软件包中的 Kuimura2-Parameter Distance模型计算进化距离，用Neighbor-Jioning法构建系统发育树，1000次随机抽样，计算自引导值(Bootstrap)以评估系统发育树的置信度。利用DnaSP(Version 3.53)计算单倍型多样性(h)(Nei&Tajima，1981)和核酸多样性(π)(Nei，1987)，评价种群遗传多样性水平。为反映遗传分化在种群之间以及种群内的分布情况，进行分子变异分析(AMOVA)(Excoffier et al.1992)。以上的种群遗传分析均利用ARLEQUIN 2.0(Schneider et al.2000)。 1.获得长为514bp的16S rRNA基因片段，种群间及种群内个体间都没有差异。将获得的16Sr RNA片段与GeneBank上42个近缘物种进行序列比对，采用NJ法构建系统发生树，结果与传统分类基本一致。 2.获得长为644bp的Cytb基因片段，仅存在两个替换位点。 3.通过对48个三疣梭子蟹个体的线粒体DNA D-Loop(617bp)测序结果进行分析，发现80个变异位点，其中转换/颠换21个，插入/缺失位点6个。各地方种群之间的遗传距离范围是0.030-0.014。七个地方种群平均遗传距离为0.021。各地方种群间的遗传差异很小，它们之间的差异上升不到亚种的水平，尚属于地理种群之间的差异。莱州种群内部遗传距离最小，遗传距离最大出现在连云港种群，其次是宁波种群，接着是青岛种群。这与各地方种群所处位置有关。 4.分子变异分析(AMOVA)表明，各地方种群间产生了一定程度的遗传分化。AMOVA分析显示各地方种群间的变异组分为17.77％，而82.23％的变异组分存在于地方种群内。 5.48个三疣梭子蟹个体D-Loop区80个变异位点共分38个单倍型，存在9个单倍型共享，其中不同地理种群间共享为4个，同一地理种群内的单倍型共享为5个。三疣梭子蟹莱州种群和北海种群拥有各自的母系起源，形成地理隔绝，建议将这两个地方种群作为不同管理单元分别进行保护。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第一章文献综述

1.1三疣梭子蟹的生物学特性及研究概况

1.1.1三疣梭子蟹的生物学特性及养殖现状

1.1.2三疣梭子蟹的研究概况

1.2线粒体DNA技术和分子遗传标记的研究进展

1.2.1线粒体DNA技术研究进展

1.2.2分子遗传标记的发展及其在系统发育中的应用

1.3蟹类种群遗传研究方法及研究进展

1.3.1遗传结构的研究背景

1.3.2遗传标记的选择及其在蟹类遗传结构分析中的应用

第二章三疣梭子蟹线粒体DNA 16S RRNA与CYTB片段序列的比较研究

2.1实验材料与方法

2.1.1材料来源

2.1.2实验试剂和仪器

2.2模板DNA的制备

2.2.1基因组DNA的提取与纯化

2.2.2模板DNA的凝胶电泳检测

2.3 PCR扩增

2.3.1模板

2.3.2引物设计

2.3.4反应体系

2.3.5反应程序

2.3.6 PCR产物的琼脂糖电泳检测

2.3.7 PCR产物的回收与纯化

2.3.8 PCR产物的测序及分析

2.4实验结果与分析

2.4.1模板DNA的制备及PCR产物测序

2.4.2单倍型分析

2.4.3系统发育序列分析与系统发生树的构建

2.5小结

第三章三疣梭子蟹线粒体DNA CYTB片段序列的比较研究

3.1实验材料与方法

3.1.1材料来源

3.1.2实验试剂和仪器

3.2模板DNA的制备

3.2.1基因组DNA的提取与纯化

3.2.2模板DNA的凝胶电泳检测

3.3 PCR扩增

3.3.1模板

3.3.2引物设计

3.3.3反应体系

3.3.4反应程序

3.3.5 PCR产物的琼脂糖电泳检测

3.3.6 PCR产物的回收与纯化

3.3.7 PCR产物的测序及分析

3.4结果与分析

3.4.1模板DNA的制备结果

3.4.2.PCR扩增结果

3.4.3测序结果

3.4.4遗传距离

3.4.5单倍型分析

3.4.6AMOVA分析

3.4.7系统发育序列分析与系统发生树的构建

3.5小结

结论

参考文献

致谢

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