厚朴酚/和厚朴酚抗草鱼呼肠孤病毒作用机制研究

摘要

草鱼为我国主要的淡水养殖鱼类。随着养殖业的高密度化，病原微生物引起的病害频繁爆发，给养殖业带来了严重的经济损失。草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus， GCRV）引起的出血病是对草鱼危害最严重的病毒性疾病。出血病易感染、死亡率高，极大地影响和危害鱼种的健康和存活，一直以来对草鱼养殖业的发展造成影响。目前，水产养殖业主要利用农药和兽药来防治病害的发生。然而，有效的、广谱性的药物仍然缺乏，其中抗病毒药物种类更是有限，并且药效极易受到病毒变异和耐药性出现的影响。中草药具有低毒、易降解、环境友好、资源丰富、使用历史悠久等优点，是安全无公害水产原料药的理想来源。本研究首先从中草药中筛选出具有抗GCRV活性的品种，随后对其主要的活性化合物进行分离鉴定，获得具有较好抗GCRV活性的单体化合物；通过体内体外的感染试验，评价其抗GCRV的活性效果；之外，本研究探索了单体化合物抗病毒引起的细胞凋亡机理和与宿主细胞之间的作用关联，以期为开发水产抗病毒药物提供理论基础。本研究取得结果如下：
　　1.中草药及单体化合物抗GCRV活性筛选
　　选取30种中草药制备成浸膏，利用MTT法测定浸膏对CIK细胞的毒性，以最大安全浓度筛选具有抗GCRV活性的植物。通过定量（RT-qPCR）初筛结果显示栝楼、厚朴和香橼表现出对GCRV复制的抑制作用，对应的浓度分别为90.0 mg/L、34.0 mg/L和240.0 mg/L。其中，栝楼能够抑制GCRV结构蛋白VP3的表达（0.53倍，P<0.05），香橼对GCRV VP5有抑制作用（0.36倍，P<0.05）；厚朴展现出较好的抗病毒活性，显著地降低了GCRV VP1（0.48倍，P<0.05）、GCRV VP3（0.52倍，P<0.05）和GCRV VP5（0.38倍，P<0.05）的mRNA表达水平。利巴韦林是一种公认的强效广谱性抗病毒药物，对GCRV的复制具有很好的抑制效果，可显著抑制GCRV VP1（0.20倍，P<0.05）、GCRV VP3（0.26倍，P<0.05）和GCRV VP5（0.39倍，P<0.05）。因此，在本研究中，其作为阳性对照药物使用。进一步对厚朴浸膏进行柱层析分离鉴定，得到厚朴的两种主要的活性成分厚朴酚与和厚朴酚。在单体化合物抗GCRV活性筛选中，厚朴酚与和厚朴酚对病毒表达有较好的抑制活性。厚朴酚对CIK细胞的安全浓度为2.51±0.51 mg/L，和厚朴酚为3.18±0.61 mg/L；在最大安全浓度下，和厚朴酚对病毒的抑制率超过70％（P<0.05），而厚朴酚的抑制率超过60%（P<0.05），二者均表现出很好的抑制活性。
　　2.厚朴酚/和厚朴酚抗GCRV活性研究
　　通过高效液相色谱检测发现厚朴酚与和厚朴酚随着时间的延长而进入CIK细胞的含量增高，在48 h达到一个峰值，随后含量减少，在96 h几乎检测不到。通过病毒与化合物共孵育后感染、先化合物处理后病毒感染以及先病毒感染后化合物处理这3种方式，利用RT-qPCR和Western blot技术检测发现，厚朴酚与和厚朴酚抑制GCRV的作用可能不在病毒吸附和侵入细胞的过程中，而是在病毒复制过程中。随后，用GCRV感染草鱼夏花，通过注射的方式给药发现，厚朴酚与和厚朴酚能够降低鱼体内病毒的含量和草鱼死亡率，并且提高机体的抗氧化能力。由此可见，厚朴酚与和厚朴酚可以作为抗GCRV感染的潜在的备选药物。
　　3.厚朴酚/和厚朴酚抗凋亡作用机制研究
　　通过扫描电镜和细胞荧光染色观察发现GCRV感染诱导CIK细胞出现了典型的凋亡特征，包括细胞肿胀、凋亡小体的形成、细胞形态的消失、核断裂和胞质的降解等。流式细胞术分析结果表明，病毒感染48 h后，21.54%的细胞发生凋亡，S期和G2/M期细胞的比例显著增加，出现细胞周期阻滞现象。然而，感染的细胞经过厚朴酚与和厚朴酚处理后，能够较好地维持正常的细胞形态，并分别降低了11.47%和13.13%的凋亡率，而且S和G2/M期的阻滞得以释放。通过RT-qPCR和Western blot检测发现，厚朴酚与和厚朴酚能够抑制促凋亡蛋白的表达（P<0.05）。为了更好地理解小分子化合物的作用机制，利用生物信息学分析，通过STITCH在线软件预测化合物与蛋白之间的互作，结合试验验证发现，在无病毒感染的情况下，厚朴酚与和厚朴酚可以下调caspase3的表达。通过原核重组技术构建caspase3蛋白原核表达质粒（pET28a-caspase3），经转化、诱导和纯化技术制备caspase3蛋白（35.8 KDa）。体外显色试验发现，厚朴酚与和厚朴酚可以阻止caspase3与底物的结合。因此，厚朴酚与和厚朴酚抑制病毒诱导的细胞凋亡，可能缘于与caspase3的直接作用。
　　4.和厚朴酚对宿主免疫应答的影响
　　通过RT-qPCR技术发现厚朴酚与和厚朴酚能够增强宿主细胞的抗病毒免疫应答。在病毒感染后，厚朴酚促进IFN-I和下游效应分子Mx1的表达，和厚朴酚增强细胞因子IL-1β、TNFα和NF-κB的表达。通过使用NF-κB抑制剂和构建转染IL-1β和TNFα的真核表达载体，发现NF-κB细胞因子应答途径在GCRV感染宿主过程中发挥着积极的抗病毒作用。此外，结合前人的研究结果，在CIK细胞中NF-κB的激活可能抑制caspase8的活化。这两个化合物通过增强宿主抗病毒应答而抑制病毒的复制，在一定程度上突破了药物的局限性而具有更为广谱的抗病效果。
　　综上所述，本研究发现厚朴能够体外抑制GCRV的复制，其主要活性成分厚朴酚与和厚朴酚能够在体外和体内有效地抑制病毒复制和增强宿主的抗氧化能力，降低死亡率，提高细胞和鱼种的成活率；厚朴酚与和厚朴酚通过抑制病毒引起的细胞凋亡，保持细胞正常的形态和功能，这极有可能是由于其与caspase3的直接作用，而对caspase3起到了降解或抑制的作用；另外，厚朴酚与和厚朴酚还能增强宿主细胞的抗病毒免疫应答，具有广谱性抗病毒意义，对防控草鱼病害具有广阔的应用前景。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 草鱼出血病概述

1.2 草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的研究进展

1.3细胞凋亡及其意义

1.4 抗病毒免疫应答

1.5 抗病毒药物研究

1.6 选题的目的和意义

第二章 中草药及单体化合物抗GCRV活性研究

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 厚朴酚/和厚朴酚抗GCRV活性研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 厚朴酚/和厚朴酚抗凋亡作用机制研究

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 和厚朴酚对宿主免疫应答的作用研究

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.4 小结

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介