碳代谢调节因子Cra调控骆驼刺泛菌在小麦根部定殖能力的分子机制研究

摘要

干旱是影响全球作物生长和生产力的主要环境压力之一，而全球变暖和水资源短缺加速了环境恶化程度。因此，当前迫切需要增强农作物抗逆性，提高其抗旱能力。植物内生菌可以帮助植物应对来自外界的逆境胁迫，增强抗压能力，而植物与微生物互作的先决条件是内生菌能够有效地定殖在植物体内。本实验室在前期研究中发现了一株具有多种促植物生长功能的内生细菌骆驼刺泛菌Pantoea alhagiLTYR-11Z。该菌株可以有效定殖在小麦根部组织并提高宿主的抗旱能力。前期通过构建该菌株的转座子插入突变体文库，筛选到一个与定殖相关的全局调控基因 cra。利用转录组数据分析（RNA-seq），发现cra敲除突变株中284个基因的转录水平与野生型相比具有显著差异，其中180个基因受到Cra蛋白的正向调控，104个受其负调控。 通过对转录组数据深入挖掘，发现eps操纵子（B1H58_14485-B1H58_14530）在?cra中的表达量中显著下调。通过实时定量PCR（Real Time PCR）、β-半乳糖苷酶酶活检测以及凝胶阻滞迁移（EMSA），本研究确定了Cra直接正向调控eps操纵子的转录，进而预测并通过点突探针验证了Cra与eps操纵子启动子的结合位点。本研究还检测了野生型P. alhagiLTYR-11Z，?cra突变体与互补菌株中胞外多糖（EPS）的产量，证实了Cra对胞外多糖生物合成的正调控作用。随后采用结晶紫染色法检测了野生型，?cra，?tuaG突变株生物膜生成量，发现Cra通过促进eps操纵子的表达而促进其生物膜的生成。 转录组数据中anti-FlhD4C2因子同源基因ydiV（B1H58_18220）在?cra中的表达下调超过2.2倍，表明Cra可能调控鞭毛的生物合成。本研究通过泳动实验发现突变 cra基因后菌株运动能力增强，与单一敲除cra基因相比，敲除cra、ydiV基因后菌株运动能力进一步提升，并且在双突菌株中回补cra未能使运动能力恢复至野生型水平，说明Cra通过调节ydiV基因的表达抑制P. alhagiLTYR-11Z的运动能力。为证明YdiV作为anti-FlhD4C2因子的活性，采用EMSA检测了His6-YdiV对His6-FlhD4C2和fliA启动子之间相互作用的影响，结果表明在P.alhagi LTYR-11Z中ydiV编码抑制FlhD4C2与fliA启动子结合的anti-FlhD4C2因子；采用同样的方法确定了Cra直接正向调控ydiV基因的表达，并预测和验证了Cra与ydiV启动子的结合位点。 在转录组数据中发现编码负责 c-di-GMP 合成的双鸟苷酸环化酶的 yedQ 的转录显著下调。本研究采用体外酶活实验检测 P.alhagi LTYR-11Z 中 YedQ 蛋白具有双鸟苷酸环化酶活性，同时确定Cra直接正调控yedQ基因的表达。通过检测胞内c-di-GMP含量发现缺失cra基因的突变体胞内c-di-GMP水平降低至正常水平的48％，说明Cra可以调节胞内c-di-GMP的水平。表型试验发现与野生型P.alhagi LTYR-11Z相比，?yedQ的运动能力增强；EPS产量降低；生物膜形成能力减弱。 综合以上结果，可以得出以下结论：Cra直接与eps操纵子、ydiV、yedQ基因启动子结合并激活其转录，促进胞外多糖的产生和anti-FlhD4C2因子的合成，并提高胞内c-di-GMP 水平，导致细菌的生物膜形成能力增强，而运动能力下降，从而增强其定殖能力。 随后，本研究通过改变培养基中的碳源，发现与糖裂解环境相比，在糖异生环境中Cra 的对 eps 操纵子、ydiV、yedQ 基因转录激活作用更加明显。在 EMSA 实验中添加FBP降低了相应Cra-DNA复合物的形成，证明P.alhagi LTYR-11Z中Cra与eps，ydiV和yedQ的启动子的结合可以被糖酵解代谢物FBP抑制。编码6-磷酸果糖激酶的pfkA基因突变导致F6P瞬时积累，但代谢中间体如FBP的浓度下降，本研究敲除pfkA基因后，eps，ydiV和yedQ的启动子活性与野生株相比显著增强，也证明了这一观点。此外，植物根系分泌物在植物-微生物互作过程中起着重要的作用，并可能调控植物促生菌中定殖相关基因的表达，本研究发现水培14天的小麦根际分泌物可以增强Cra对其靶基因表达的激活作用。 综上所述，本研究在P.alhagi LTYR-11Z中确定了Cra响应不同碳源调节胞外多糖合成，鞭毛生物合成和 c-di-GMP 的合成，进而调控其定殖行为的作用机制，并建立了一个模型来解释细菌中碳代谢调节因子Cra介导的定殖调控机制。本研究提出了植物内生菌响应环境中不同碳源调节其定殖行为的新策略，取得的研究成果对于今后进一步深入研究细菌的碳源依赖性定殖行为奠定基础，具有重要的理论价值和潜在应用前景。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1植物内生菌概述

1.2内生菌与农作物相互作用协助抗逆

1.3生物膜

1.4全局转录因子Cra

1.5研究的目的与意义

1.6技术路线

2.1引言

2.2材料和方法

2.3结果分析

第三章 Cra的调控功能鉴定

3.1引言

3.2材料和方法

3.3结果分析

第四章 碳源影响Cra的调节功能

4.1引言

4.2材料和方法

4.3结果分析

第五章 分析与讨论

第六章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介