弱阳离子交换色谱固定相对还原变性溶菌酶的折叠贡献

摘要

全文包括四个部分:1.文献综述:蛋白折叠的研究具有重大的理论意义和使用价值,液相色谱法(LC)是近年来发展最快的方法之一.该文仅对LC固定相对蛋白折叠的贡献以及二硫键折叠的研究进展进行了全面地综述.2.为了减少不可逆吸附,在硅胶表面先键合了一层聚乙二醇(PEG),以使硅胶表面变成亲水性,然后再对其表面进行化学改性使其成为弱阳离子交换(WCX)介质.亲水性的增强能够减少和避免生物大分子的不可逆吸附,并且可以维持其足够高的生物活性回收率.为了比较PEG对蛋白质复性的影响,该文用键合了不同分子量PEG的PEG200、PEG400、PEG600、PEG1000四种柱子,分别比较了它们对还原变性Lys复性的影响.结果表明从对还原变性Lys复性以及柱子稳定性方面考虑,键合PEG400的柱子效果最好.3.由于在WCX中,在弱的离子交换剂上配体结构或组成的稍微变化就会对蛋白折叠产生较大的影响.研究了四种不同配基(3-硝基邻苯二甲酸酐、丁二酸酐、邻苯二甲酸酐、苯基丁二酸酐)的弱阳离子交换色谱填料对还原变性的Lys复性效率的影响.结果表明配基为3-硝基邻苯二甲酸酐的WCX柱复性效果最好.指出一个新概念,活性回收率(R<,B>)与质量回收率(R<,M>)之比R<,(B/M)>,通过实验检验,R<,(B/M)>可以很好的反映复性条件的好坏.4.用WCX对还原变性Lys的复性进行了研究.考察了流动相中脲浓度及盐种类对用WCX对Lys复性的影响,结果表明当流动相中含有3.0mol·L<,-1>的脲及1.0mol·L<,-1>硫酸铵时能提高其生物活性回收率.在此WCX柱上,Lys的保留呈现离子交换和疏水双保留机理.发现在硅胶基质的WCX柱上,当蛋白浓度为15.0mg·mL<,-1>到50.0mg·mL<,-1>时,用WCX折叠的复性产率均高于用稀释法的复性产率;在蛋白浓度为20.0mg·mL<,-1>时活性回收率达到最高,为95.4％.同时还考察了流动相组成、脲浓度、pH值、流速、温度和复性时间等对复性的影响.

目录

文摘

英文文摘

独创性说明

第一章文献综述

1.1 蛋白质复性的研究意义

1.2 蛋白质的液相色谱复性技术

1.3 液相色谱固定相对蛋白质折叠的贡献

1.3.1 SEC

1.3.2 AFC

1.3.3 HIC

1.3.4 IEC

1.4 二硫键折叠的研究进展

1.4.1 产生正确二硫键的一般方法

1.4.2二硫键折叠的LC法

1.5 还原变性溶菌酶复性的研究

参考文献

第二章不同亲水基对用WCX柱对还原变性Lys复性的影响

2.1 前言

2.2 材料和方法

2.2.1材料

2.2.2装置

2.2.3还原变性溶菌酶的制备

2.2.4弱阳色谱填料的制备

2.2.5用离子交换色谱复性还原变性的溶菌酶

2.2.6分析方法

2.3 结果与讨论

2.3.1四种柱子对Lys色谱行为的比较

2.3.2四种柱子对还原变性Lys复性效率的影响

2.4 结论

参考文献

第三章不同配基的WCX柱对还原变性Lys复性的影响

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1材料

3.2.2装置

3.2.3还原变性溶菌酶的制备

3.2.4弱阳色谱填料的制备

3.2.5用离子交换色谱复性还原变性的溶菌酶

3.2.6分析方法

3.3 结果与讨论

3.3.1四种不同配基的WCX柱的标准蛋白分离图

3.3.2四种不同配基的WCX柱对Lys的色谱行为比较

3.3.3四种不同配基的柱子对还原变性Lys复性效率的影响

3.3.4还原变性蛋白复性所面临的问题

3.3.5还原变性蛋白复性的一般规律

3.3.6用R(B/M)予以对WCX对还原变性Lys的条件的优化

3.4 结论

参考文献

第四章WCX-1柱对还原变性Lys的折叠的优化研究

4.1 前言

4.2 材料和方法

4.2.1材料

4.2.2装置

4.2.3还原变性溶菌酶的制备

4.2.4弱阳色谱填料的制备

4.2.5用SEC脱除从IEC上所收样品中的GSH/GSSG

4.2.6用离子交换色谱复性还原变性的溶菌酶

4.2.7稀释法

4.2.8分析方法

4.3 结果与讨论

4.3.1流动相组成

4.3.2Lys浓度

4.3.3 pH值

4.3.4 GSH/GSSG比例

4.3.5流动相流速

4.3.6温度

4.3.7复性动力学研究

4.3.8固定相对二硫键对接的影响

4.4 结论

参考文献

致谢