基于Au@Fe3O4纳米复合微粒的细胞分选体系的构建

摘要

细胞分选被广泛用于细胞生物学研究、疾病的诊断检测和治疗领域。基于磁性微粒进行细胞分选技术发展了三十多年，该方法较传统方法具有操作方便、分选效果佳、应用范围广等特点，体系中最重要的影响因素是磁性微粒的类型和性能。与微米级磁性微粒相比，纳米级磁性微粒以可稳定捕获细胞、不影响细胞活性并可兼容流式细胞仪，而备受关注。实际上，基于纳米级磁性微粒的细胞分选有一些关键技术需要突破。一方面，纳米级磁性微粒对外磁场响应性较弱，因而对永磁体所具备磁场强度大小有相应的适配要求;另一方面，目前广泛使用的磁性激活的细胞分选技术(magnetic activated cell sorting，MACS)必须以可提供强磁场的磁分离柱完成纳米级磁性微粒对细胞的分选。但这种特殊分离装置价格昂贵，作为一次性耗材有时会被堵塞。因此本研究拟通过对不同组成和构型的纳米级磁性微粒配合简便常规的磁分离装置在细胞分选中的应用进行探索，建立简便、快速、高效的细胞分选系统。
　　本人所在团队前期积累了大量的GoldMag金磁微粒材料及其应用研究基础，基于间接细胞分选原理，将经典核壳结构纳米微粒Fe3O4@Au GoldMag NPs (50 nm)、Fe3O4@Au GoldMag NPs (30 nm)，新型花瓣型纳米微粒Au@Fe3O4 GoldMag NPs (30 nm)及聚合物包覆磁性微粒Mono-Fe3O4 (50nm)四种纳米级磁性微粒修饰链亲和素(streptavidin，SA)以表面功能化。对上述纳米微粒理化性能和SA固定化容量进行表征，筛选出适合细胞分选的纳米磁性微粒。后以CD4+T细胞分选为模型，通过对捕获抗体、标记抗体、磁性微粒用量、细胞总数以及磁分离器类型的优化，建立CD4+T细胞分选体系，并与国际知名厂商德国美天旎MACS细胞分选体系进行对比，评估所建立方法的特异性及准确性。
　　四种不同的磁性微粒经表征分析后，优选新型花瓣型Au@Fe3O4 GoldMag NPs (30 nm)，生物素化的一抗结合靶细胞，通过生物素-链亲和素结合靶向锚定目的细胞，达到分选目的，与此同时，几种不同性能的磁分离器也相应做了评价。结果表明，使用DynalMag-Spin磁性分离器，在60μL的标记抗体、65μg的磁性微粒的体系中，分选3.5×106人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)中的CD4+T细胞，其回收率可达93.34％，纯度可达95.21％。基于上述建立的细胞分选系统，我们亦成功实现了CD8+T细胞的成功分离，其回收率为94.13％，纯度为95.86％。这表明花瓣型金磁微粒可作为人外周血免疫细胞分选的一个普适性载体。此外，在建立乳腺癌细胞（MCF-7）作为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)模型的磁性微粒捕获体系时，使用新型花瓣型Au@Fe3O4 GoldMag NPs可以在PBS缓冲液或100％新生牛血清(fetal bovine serum，FBS)环境中捕获约25个癌细胞(早期肿瘤患者外周血中CTCs为1-50个/mL)，回收率可达88±2.5％，为系统构建稀有细胞的分选工作奠定了一定的工作基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 细胞分选的意义

1．1 细胞分选技术对研究细胞生物机制的意义

1．2 细胞分选技术对疾病诊断的意义

1．3 细胞分选技术对疾病治疗的意义

2 细胞分选方法概述

3 基于免疫学原理的细胞分选技术

3．1 流式细胞术(FACS)

3．2 磁性分选技术(MACS)

4 磁性微粒概述

4．1 四氧化三铁／金纳米复合微粒

4．2 构型及表面修饰

5 立项依据及研究内容

第二章 磁性微粒的制备、筛选及细胞分选体系的建立

1 材料与仪器

2．1 磁性微粒的制备

2．2 磁性微粒的表征

2．3 磁性微粒表面修饰及功能化评估

2．4 细胞分选体系的建立

2．5 分选结果与标准方法的比对(MACS)

3 结果与讨论

3．1 磁性微粒的表征

3．2 磁性纳米微粒表面PAA修饰

3．3 核壳结构金磁微粒链亲和素的偶联

3．4 花瓣结构金磁微粒链亲和素的偶联

3．5 CD4+T细胞间接分选体系磁性微粒的优选

3．6 Au@Fe3O4细胞分选体系的建立及效果评价

4 小结

第三章 基于Au@Fe3O4载体CD8+T细胞的分选

1 材料与仪器

2 实验方法

2．1 CD8+T细胞背景

2．2 CD8+T细胞分选体系的建立

3 实验结果

3．1 Au@Fe3O4细胞分选CD8+T细胞效果评价

4 小结

第四章 基于Au@Fe3O4 GoldMag NPs(30 nm)分选稀有细胞初步探索

1 材料与仪器

2 实验方法

2．1 循环肿瘤细胞背景

2．2 模型的构建

2．3 CTCs分选体系的建立

3 实验结果

3．1 CTCs分选结果

3．2 共聚焦显微镜

4 小结

全文总结

参考文献

致谢