七氟烷后处理对窒息性心搏骤停后脑损伤的保护作用及机制的探究

摘要

心搏骤停(cardiac arrest，CA)是世界范围内的主要致死原因，能够造成全脑严重的缺氧缺血性损害。虽然心肺复苏(cardio-pulmonary resuscitation，CPR)技术的提高和急救医疗体系的完善能挽回部分患者的自主呼吸和循环，提高最初的复苏成功率，但后期的存活率及生存质量却令人沮丧。研究表明，仅不足50％的患者在心搏骤停后得以长期生存，而其中大多患者会遗留有不同程度的认知和行为功能障碍。尽管人们进行了大量的基础研究和临床实践，迄今为止仍没有找到能够有效减少复苏后脑损伤的理想脑保护药物，这已经成为一个亟待解决的临床医学难题。近年来，有研究表明七氟烷后处理能够显著改善局灶性脑损伤的神经缺损，而对心肺复苏后的全脑损伤的保护作用却鲜有报道。
　　磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)通路为体内最为重要的信号通路之一，参与细胞的生长、存活、代谢及凋亡，在药物处理的动物局灶性脑缺血损伤或全脑缺血损伤模型中发挥了重要的作用。糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是PI3K/Akt通路的重要下游因子之一，它除了广泛参与体内细胞的生长和发育，还兼有调节血糖和促进肿瘤的形成的作用。研究表明，GSK-3β不仅在四血管栓塞所致的全脑损伤中具有保护作用，而且在关于胰岛素受体的大量研究中发现，GSK-3β还可以通过多种机制来实现体内糖代谢的调节，涉及糖代谢的各个环节，如影响胰岛β细胞的功能、糖原合成等。
　　因此，本实验建立大鼠窒息性心搏骤停模型，在复苏即刻给大鼠吸入不同浓度七氟烷，通过观察复苏后大鼠血糖值、血清神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)值、海马凋亡蛋白P53表达情况、组织病理损伤情况以及大鼠整体认知行为能力的变化，研究七氟烷后处理对窒息性心搏骤停后脑损伤的保护作用；在上述实验的基础上，静脉给予PI3 K特异性拮抗剂，评价其对七氟烷后处理神经保护作用的影响，揭示PI3 K/Ak t通路在七氟烷后处理脑保护中的作用，探究其与抗凋亡和糖代谢调节之间的关系，为心肺复苏脑损伤的救治提供新的思路和方法。
　　实验一：不同浓度七氟烷后处理对窒息性心搏骤停大鼠脑损伤的保护作用
　　目的:研究表明，在局灶性脑损伤模型中，七氟烷后处理能够显著改善神经缺损，而对心肺复苏后的全脑损伤的保护作用研究却较少。本实验旨在评价不同浓度七氟烷后处理对大鼠心搏骤停后全脑缺血损伤的保护作用。
　　方法:将80只成年雄性SD大鼠随机分为五组：假手术组(sham组)、对照组(control组)、0.5倍最低肺泡有效浓度(minimum alveolar concentration，MAC)、1.0 MAC和1.5 MAC七氟烷后处理组（0.5SP组、1.0SP组及1.5SP组）。Control组、0.5SP组、1.0SP组及1.5SP组建立8min窒息性心搏骤停模型，后给予心肺复苏抢救；各七氟烷后处理组在复苏即刻给予间断吸入七氟烷2次，每次5min，间隔10min，使用气体分析仪确保浓度分别为1.3%、2.5%和3.8%，而control组大鼠仅吸入100%氧气。记录各组大鼠复苏成功率、复苏后72h血糖值、血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)含量、海马CA1区神经元形态学变化、海马区P53的表达、复苏后24、72h和7d的神经功能缺损评分(neurological deficit score，NDS)，及复苏后7d至11d的大鼠空间学习记忆能力。
　　结果:各处理组大鼠复苏成功率没有统计学差异，1.0SP组及1.5SP组在复苏后72h的血糖值、NSE值明显较control组低（P<0.05），海马 CA1区有较多的存活神经元、较少的凋亡蛋白P53表达（P<0.05），神经功能和空间学习记忆能力也较control组水平高（P<0.05），而0.5SP组并未表现出明显的神经保护作用。
　　结论:较高浓度（1.0MAC和1.5MAC）的七氟烷后处理可以显著改善大鼠窒息性心搏骤停所致的全脑损伤。
　　实验二：七氟烷后处理减轻窒息性心搏骤停脑损伤过程中PI3K/Akt的作用研究
　　目的: PI3K/Akt通路是体内最为重要的信号通路之一，参与细胞的生长、存活、代谢及凋亡。而其下游因子 GSK-3β可以从糖原合成等多方面参与机体糖代谢调节过程，本文旨在探索七氟烷的脑保护作用是否与PI3K/Akt通路介导的抗凋亡及GSK-3β参与的糖代谢调节作用有关。
　　方法:80只健康雄性SD大鼠随机均分为五组：假手术组(sham组)、对照组(control组)、1.0MAC七氟烷后处理组(SP组)、PI3K特异性抑制剂Wortmannin+七氟烷后处理组(W+SP组)和单纯Wortmannin组(W组)。Sham组、control组和SP组具体处理方法同实验一； W+SP组于窒息前30min经股静脉给予Wortmannin，并按实验一方法建立心搏骤停模型，进行心肺复苏，吸入七氟烷并确保呼气末浓度为2.5%；而 W组仅于窒息前30min经股静脉给予Wortmannin、并建立心搏骤停模型。记录各组大鼠复苏成功率、复苏后72h血糖值、海马CA1区神经元形态学变化，并观察海马区凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax，通路相关蛋白pAkt/Akt、pGSK-3β/GSK-3β等的表达。
　　结果:各组大鼠复苏成功率没有统计学差异；较control组，SP组在复苏后72h有较低的血糖值（P<0.05），海马 CA1区有较多的存活神经元（P<0.05），较多的抗凋亡蛋白 Bcl-2和较少的凋亡蛋白 Bax（P<0.05），以及上调了下游通路磷酸化蛋白pAkt及pGSK-3β（P<0.05），而对总蛋白没有显著影响；而W+SP组较 SP组各结果均有部分拮抗，如血糖值略有升高（P<0.05），存活神经元有所减少（P<0.05），凋亡相关蛋白也有显著的变化（P<0.05），并且部分降低了pAkt和pGSK-3β蛋白的表达（P<0.05）。
　　结论:在窒息性心搏骤停模型中，七氟烷对全脑损伤的保护作用不仅与PI3K/Akt介导的抑制凋亡作用有关，可能还与GSK-3β参与的糖代谢调节作用密切相关。

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前言

文献回顾

1 心搏骤停的脑损伤机制及防治

2 七氟烷后处理的脑保护作用

3 PI3K/Akt/GSK-3β信号通路

实验一 不同浓度七氟烷后处理对窒息性心搏骤停大鼠脑损伤的保护作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 七氟烷后处理减轻窒息性心搏骤停脑损伤过程中PI3K/Akt的作用研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢