长时程二甲双胍预处理通过诱导自噬发挥脑保护作用的机制研究

摘要

背景：脑卒中是全世界致死的第二大原因和致残的主要原因。脑卒中后的致残往往会给患者带来如偏瘫，失语等后遗症，使患者生活质量大大下降，同时给患者家庭和社会带来沉重的负担。目前关于脑卒中的发病机制已有大量的研究报道，但临床上仍然缺少有效的治理措施。研究发现临床上用于治疗二型糖尿病的一线药物二甲双胍能够有效的降低脑卒中发生率，并减少脑卒中后梗死面积，且其神经保护作用与降糖作用并没有明显的关联[1,2]。而二甲双胍作为AMPK的激活剂，更引起了人们的关注和研究。大量文献报道AMPK作为能量的主要感受器和调节器在脑卒中发生后起着重要的作用,并能够通过下游多种通路包括抑制小胶质细胞的活性，抑制NF-kB，减轻炎症介质的释放，缓解炎症的损伤；抑制MMP-9的表达，增加了ZO-1等蛋白的表达，减轻血脑屏障的损伤；对PCG-a以及下游分子TFAM，NRF1的作用，增加线粒体的再生，抑制神经元凋亡。
　　但是作为AMPK下游重要的调控靶点—自噬，在长时程二甲双胍预处理后在脑卒中发挥何种作用以及在长时程二甲双胍预处理AMPK的活性升高可能会影响脑组织的代谢增加糖酵解作用，促进乳酸的水平增加以及对热休克蛋白表达的影响尚未有所报道。本实验运用C57BL/6小鼠，采用大脑中动脉阻塞（MCAO）模型进行研究，以及利用抑制剂3-MA，Compound C等研究自噬在长时程二甲双胍预处理时的脑保护作用。
　　实验一：检测观察长时程二甲双胍预处理后脑组织的保护作用及机制
　　目的：探讨长时程二甲双胍预处理后缺血再灌注6h AMPK活化水平的变化以及乳酸的水平
　　方法：1）观察长时程二甲双胍预处理后脑组织的保护作用。采用C57BL/6小鼠随机分为2组：MCAO组和Met+MCAO组，建立MCAO模型，检测缺血再灌注后24h小鼠神经行为学评分以及脑梗死容积。2）在缺血再灌注后早期6h AMPK的活化水平和乳酸的水平。采用C57BL/6小鼠随机分为4组，Sham组，Met组，MCAO组和Met+MCAO组，建立MCAO模型。观察缺血再灌注后6h AMPK活化水平的表达。3）观察长时程二甲双胍预处理后，缺血再灌注后24h后，缺血半暗带凋亡细胞的表达。
　　结果：长时程二甲双胍预处理后能够有效地减少小鼠脑缺血再灌注24h梗死面积，改善神经行为学评分。在长时程二甲双胍预处理组缺血再灌注后6h时 AMPK活化水平相比MCAO组反而降低,乳酸水平降低，缺血半暗带细胞凋亡减少。
　　结论：长时程二甲双胍预处理后能够起到脑保护作用，降低缺血再灌注6h AMPK的活化水平，降低乳酸水平。
　　实验二自噬在长时程二甲双胍预处理的表达以及神经保护作用的机制研究
　　目的：探讨自噬在长时程二甲双胍预处理的表达以及作用的研究
　　方法：1）观察长时程二甲双胍预处理后自噬水平的变化。采用C57BL/6小鼠随机分为4组：Sham组、Met、MCAO组和Met+MCAO组。建立MCAO模型观察在缺血再灌注后6h，24h的自噬的表达水平。免疫荧光观察LC3的表达情况，western blot检测LC3，Beclin-1以及p62的表达。2）侧脑室给予抑制剂3-MA后，观察自噬对长时程二甲双胍预处理后脑保护作用的影响。采用 C57BL/6小鼠随机分为3组Met+MCAO、Veh+Met+MCAO组和3-MA+Met+MCAO组建立MCAO模型，检测缺血再灌注后24h小鼠脑梗死容积以及神经行为学评分3）侧脑室给予抑制剂3-MA后，观察长时程二甲双胍预处理后自噬的表达水平。采用 C57BL/6小鼠随机分为3组Met+MCAO组、Veh+Met+MCAO组和3-MA+Met+MCAO组,建立MCAO模型。western blot检测LC3，Beclin-1以及p62的表达，检测缺血再灌注后6h，24h的自噬水平的变化。。4）侧脑室给予抑制剂3-MA后，观察长时程二甲双胍预处理后Hsp70表达水平。采用 C57BL/6小鼠随机分为3组 Met+MCAO、Veh+Met+MCAO组和3-MA+Met+MCAO组,建立MCAO模型，western blot检测 Hsp70表达。5）腹腔注射抑制剂Compound C后，观察长时程二甲双胍预处理后对脑保护作用的影响。采用C57BL/6小鼠随机分为3组Met+MCAO组、Veh+Met+MCAO组和CC+Met+MCAO组,建立MCAO模型。检测再缺血再灌注后24h小鼠脑梗死容积以及神经行为学评分。6）观察腹腔注射抑制剂Compound C后，检测在缺血再灌注后6h，24h的自噬水平的变化。采用 C57BL/6小鼠随机分为3组 Met+MCAO、Veh+Met+MCAO组和CC+Met+MCAO组,建立MCAO，western blot检测LC3，Beclin-1以及p62的表达。7）腹腔注射抑制剂 Compound C后，观察长时程二甲双胍预处理后缺血再灌注24hAMPK的活化表达水平及在缺血再灌注6h时乳酸的变化水平。采用C57BL/6小鼠随机分为3组 Met+MCAO组、Veh+Met+MCAO组和CC+Met+MCAO组,建立MCAO模型，western blot和乳酸试剂盒检测。
　　结果：长时程二甲双胍预处理后在Met组6h，24h及Met+MCAO组在缺血再灌注6h，24h时免疫荧光显示LC3表达增多以及western blot显示自噬相关蛋白表达升高。在侧脑室给予抑制剂3-MA后，3-MA+Met+MCAO组相比Met+MCAO组在缺血再灌注后24h脑梗死面积扩大神经行为学评分下降同时 western blot结果显示在3-MA+Met+MCAO组自噬的相关表达蛋白降低，且在缺血再灌注后24h时发现在3-MA+Met+MCAO组Hsp70的水平也发生降低，证明自噬也参与了对Hsp70的调节。在腹腔注射抑制剂 Compound C后，发现在24h时相比 Met+MCAO组，CC+Met+MCAO组脑梗死面积扩大及神经行为学评分下降而 CC+Met+MCAO组乳酸的水平与Met+MCAO组降低，在缺血再灌注24h时 CC+Met+MCAO组相比Met+MCAO组AMPK活化水平也下降同时自噬的水平也明显的降低，进一步证实在长时程二甲双胍预处理时自噬发挥着主要神经保护作用。
　　结论：长时程二甲双胍预处理能够增加自噬的表达水平发挥主要的神经保护作用，同时自噬参与了对Hsp70的水平的调控。
　　小结：证实在长时程二甲双胍预处理后 AMPK的活化水平在早期6h降低，降低了乳酸的水平减轻了细胞凋亡。而同时提高了自噬的水平的表达，参与了对 Hsp70的调节发挥脑保护作用。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、二甲双胍及其临床应用

二、二甲双胍的神经保护作用

三、AMPK的组成及分布

四、AMPK的调节以及在外周缺血中的作用

五、AMPK在中枢神经系统（CNS）的作用

六、Hsp70在神经组织的作用

七、AMPK对下游分子自噬的调控

八、自噬的调控

实验一 长时程二甲双胍预处理具有脑缺血保护作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 长时程二甲双胍预处理主要通过升高自噬水平来发挥脑保护作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢