难治性根尖周炎粪肠球菌临床分离株的生物学特性及其抗菌方法的研究

摘要

难治性根尖周炎通常指使用常规的根管治疗方法反复进行治疗却仍迁延不愈的根尖周炎，是临床治疗的难点与重点。在持续感染根管中通常存在着拥有顽强生命力的粪肠球菌（Enterococcus faecalis,E.f），它具有多种不同于其他细菌的独特的生物学特性，目前由于存在实验设计方法及病例数量等方面因素的限制，对于难治性根尖周炎病例中E.f的检出、临床分离株与标准株之间的生物学表型差异及关于临床分离株的杀菌效果研究尚无足够的证据。故本实验的主要目的是检测E.f在难治性根尖周炎病例中的检出率及其与临床症状之间的相关性，分析E.f临床分离株的表型差异及探讨几种抗菌方法对分离株的杀灭效果，主要分为以下三部分实验：
　　1.临床样本中粪肠球菌的分离鉴定及表型测定
　　按照已设定的纳入排除标准收集2014年12月至2015年3月之间因难治性根尖周炎（至少接受过2次正规根管治疗后，出现症状者）在本科室进行根管再治疗的病例信息，使用 Reciproc单支锉按照事先设定的步骤采集根管内的细菌样本，实验室分离培养，16srRNA测序鉴定。将E.f阳性样本进行生物学特性的测定，分别使用结晶紫染色法结合紫外分光光度测定值来检测生物膜形成能力、细菌计数法结合OD600值法测定细菌生长曲线及使用96孔板法测定各菌株的耐酸碱能力。最后将细菌的检出率与临床症状之间的关系进行统计分析，将各项生物学特性结果进行比对，分析临床分离株与标准株之间的表型差异。
　　结果表明，本实验共采集难治性根尖周炎患牙中的细菌样本39例，经分离鉴定共得到E.f临床分离株18例，其检出率为46.15％。与此同时，在对16srRNA序列测定结果与基因组的比对中发现，各临床分离株均与E.f V583的序列存在高相似度（≈99%）。E.f的检出与疼痛、肿胀、窦道及无症状四组之间均无统计学差异（P＞0.05）。E.f标准株V583与18株临床分离株（S1-S18）均可以形成生物膜，且与标准株比较CV染色OD570值有显著性差异（P＜0.05）的共7株，但在细菌生长曲线、耐酸碱能力方面没有显著性差异（P＞0.05）。细菌生物膜形成能力与临床症状之间没有明显相关性（P＞0.05）。
　　2.现有根管消毒方法对临床分离株杀菌效果的研究
　　超声冲洗作为目前临床应用中被普遍认可的消毒方法，已纳入规范的根管消毒步骤。而最新引进的激光技术以其良好的消毒效果也已被更多的临床医生及科研工作者认可。基于目前对激光和超声激活技术用于根管消毒的作用比较的研究结果来看，在临床应用中此两种技术哪一个可以达到更好的根管消毒效果，其结论大不一致。因此，我们拟通过系统评价的方法来解决这一临床问题。
　　即便本领域实验研究仍存在一些不足，但我们可以看出：LAI包括PIPS在内的激光处理方式有着其独特的优点。因此，在本领域设计更加完善的高质量文章供meta分析（定量分析）之前，我们暂且认为激光的作用效果略好于超声处理组。随后，在体外建立 E.f饥饿状态的离体牙感染根管模型，使用系统评价得出的优势消毒方法与几种根管消毒剂对E.f临床分离株与标准株进行杀菌效果研究。在使用Er:YAG激光配合NaOCl这一特定组合对E.f标准株ATCC29212及临床分离株中生物膜形成能力最强的一株进行杀菌实验中发现，无论在标准株还是分离株的感染根管中，Er:YAG激光组与 NaOCl阳性对照组在根管表面及各深度处杀菌效果均显著优于阴性对照组（P＜0.05）。两组细菌的Er:YAG激光处理组杀菌效果均好于5.25% NaOCl组。另外，随着深度增加，两组细菌的细菌减少率有降低的趋势，且在对同一深度处不同细菌的比较中发现，临床分离株与大多数相关实验中应用的标准菌株 ATCC29212相比更难被彻底清除。
　　综上所述，在现有实验的基础上我们得出：E.f在难治性根尖周炎病例中的检出率较高，遇到这样的病例时选择Er:YAG激光配合NaOCl进行辅助根管消毒可能会是较好的选择，另外，今后对粪肠球菌进行杀菌实验中应注意分离自肠道的E.f ATCC29212可能与持续感染根管内实际存在的粪肠球菌存在一定的差异。

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文献回顾

1 根管系统内感染的持续存在

2 根管内持续感染的细菌学研究

2.1持续感染根管内的细菌检测

2.2持续感染根管内的细菌生物膜

3 顽固性致病菌粪肠球菌的常用杀灭方法研究

3.1常用冲洗剂

3.2根管内封药

3.3物理方法

3.4其他抗菌方法

第一部分 临床样本中粪肠球菌的分离鉴定及表型测定

实验一 临床样本采集及粪肠球菌分离鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 粪肠球菌分离株表型测定及其与临床症状相关性

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 现有根管消毒方法对临床分离株杀菌效果的研究

实验一 激光活化冲洗法与超声被动冲洗技术的根管消毒效果比较的系统评价

1 研究对象

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 Er：YAG激光对临床分离株的杀灭效果研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢

附件