引起驴驹腹泻的致病性大肠杆菌分离鉴定及复合疫苗研制

摘要

驴产业是我国重要的区域特色畜牧业。腹泻是规模化驴场最常见的一类疾病，也是影响犊驴驹成活率的主要因素之一。 1. 规模驴场腹泻病的调查 2015年 ~2017年，对49个规模化驴场调查显示：0~6月龄驴驹腹泻病的场发病率约为67.3%（33/49），驴驹个体发病率为23.1%（1099/4755），其中高发日龄为15~45 d。约有15%的病例在发病48 h~72 h内死亡，发病后驴驹的生长发育性能受到严重影响，造成了严重的经济损失。引起驴驹腹泻的因素比较复杂，与长途运输应激、饮水不洁过凉、卫生状况差、寄生虫（蛔虫）的感染、病原微生物的侵袭等有关。调查发现致病性大肠杆菌（血清型O78、O101和O8）感染是最主要的致病性因素。腹泻驴驹的病变包括肠道组织粘膜脱落、绒毛断裂、粘膜水肿、出血等，符合感染性肠炎的组织学特征。 2. 驴驹腹泻病例中致病性大肠杆菌的分离鉴定 2015年 ~2017年，从聊城市规模驴场腹泻病料中分离到416株大肠杆菌，经纯化培养、电镜分析，全自动生化鉴定，动物感染试验和16S rRNA测序，共鉴定出85株致病性大肠杆菌。电镜分析表明纯培养物的平均大小为329.4 nm×223.5 nm。使用全自动细菌鉴定仪通过生化鉴定方法可以快速的完成细菌学鉴定。对致病性大肠杆菌的敏感药物包括氟苯尼考、阿米卡星、妥布霉素等，不敏感药物包括哌拉西林、氨苄西林、头孢噻吩、头孢西叮等。DNAStar Megalign对16S rRNA序列分析表明7株E.coli驴源分离株之间的同源性为98.2%~99.7%，与牛、马、猪、禽和人源菌株的同源性分别为97.0%~99.9%， 88.6%~91.0%， 97.7%~99.6%， 95.8~97.3和98.8~99.9%，表明其来源复杂。 3. 驴驹致病性大肠杆菌全基因组序列分析 对两株致病性大肠杆菌分离株（E.coli La18, E.coli Lb73）菌株，进行基因组重测序得到的原始数据量进行过滤后数据量为2.55 G，原始数据在NCBI数据库中登录号为SRP148724。将其序列分别与NCBI中登录的马源大肠杆菌菌株（Escherichia coli 3.2608 Contig0022）和牛源大肠杆菌菌株（Escherichia coli O157:H7 strain FRIK2455）参考基因组序列比对。对比对结果评估，突变质控结果共有35586个SNP、20805个SNP，共有4157个InDel、23821个InDel；对结果进行突变声明和注释，分析得到通过比对基因组突变密度的差异，发现与NZ-AEZS000010.1染色体、NZ-CP015843.2染色体，突变位点、突变频率最多；本试验通过突变类型柱状图分析，在13种突变类型中发现3种（downsteam-gene-variant 、synonymous-variant、upstream-gene-variant）突变类型的计数最高，分别达到175222个、27751个、178117个；通过突变位置分布统计发现：3个基因组区域（DOWNSTREAM、EXON、UPSTREAM）突变数最高。 4. 驴驹致病性大肠杆菌新型疫苗的研制 将E.coli La18分离株在CGMCC进行细菌保藏（登记号为CGMCC No.14058）。使用其菌体和K99亚单位成分制成复合疫苗，经稳定性试验、攻毒保护试验、安全试验和对比试验，测定了临床保护率。菌体与疫苗亚单位的最佳比例为75 亿：2.375 mg。与对照组相比，临床保护率达到95.7%。 综上所述，在驴驹腹泻病例中致病性大肠杆菌的分离鉴定、全基因组重测序和复合疫苗的研制，将为驴驹腹泻性疾病的防治提供重要理论依据和技术支撑。

目录

声明

前言

第一章 绪 论

1.1 国内外研究现状

1.2 研究目的和意义

第二章 驴腹泻性疾病调查

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 驴致病性大肠杆菌的分离与鉴定

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 驴致病性大肠杆菌基因组重测序分析

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 驴致病性大肠杆菌复合疫苗的研制

5.1 试验材料

5.2 试验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文