纤毛虫eRF1识别终止密码子特异性的研究

摘要

真核生物中第一类肽链释放因子(eukaryotic polypeptide release factor, eRF1)识别三个终止密码子UAA、UAG和UGA,而在原生动物纤毛虫中终止密码子发生重新分配现象,这些生物的eRF1对终止密码子的识别表现出特异性。早前研究表明eRF1的N端结构域的一些氨基酸残基与终止密码子的识别有关,那么,这些氨基酸的变化很可能影响eRF1识别密码子的功能,产生功能特异的eRF1,从而导致这些生物中终止密码子的重新分配。最近研究发现真核生物eRF1的N端结构域中,高度保守的模体(motif)“TASNIKS”和“Y×C××F”对终止密码子的识别特异性具有明显的影响,但这些结论不断受到挑战。使用不同的实验体系和不同生物的eRF1,这些模体结构对eRF1识别终止密码子特异性的决定作用存在明显差异。另外,eRF1的翻译后修饰对其识别密码子的性质具有重要的影响,那么,纤毛虫eRF1识别密码子的特异性是否受到其翻译后修饰的影响呢?本实验通过构建纤毛虫eRF1与酵母eRF1不同模体结构组成的嵌合体,分析了不同模体在密码子碱基识别过程中的具体功能;用基因突变方法向纤毛虫eRF1中引入或者删除磷酸化激酶识别位点,分析了磷酸化修饰对eRF1识别密码子特异性的影响。
　　首先,将日本赭纤虫( Blepharisma japonicum)和八肋游仆虫( Euplotes octocarinatus)eRF1的N端,与酵母(Saccharomyces cerevisiae)eRF1的的M和C端结构域融合,得到结构域嵌合的Bj/Sc eRF1和Eo/Sc eRF1。进一步通过搭桥PCR的方法构建了赭纤虫和游仆虫的N端模体结构嵌合体:Bj(1-76aa)/Sc(76-149aa)-N, Sc(1-75aa)/Bj(77-152aa)-N;Eo(1-74aa)/Sc(76-149aa)-N,Sc(1-76aa)/Eo(75-152aa)-N;Sc(1-38aa)/Eo(38-74aa)/Sc(76-149aa)-N,Eo(1-37aa)/Sc(39-76aa)/Eo(75-152aa)-N。其中1-38aa包括“GT×”模体,38-74aa包括“TASNIKS”模体;75-152aa包括“Y×C××F”模体。利用第一类肽链释放因子基因敲除的酵母菌株YDP447、双荧光素酶报告系统和质粒洗牌技术,分析了eRF1的N端嵌合体识别终止密码子的性质和活性。结果显示赭纤虫的“GT×”区和“TASNIKS”区对三个终止密码子的识别有很重要的作用,“Y×C××F”区参与了第二位碱基G2识别。游仆虫的N端嵌合体却没有表现出特异性,为了更进一步的研究,我们在游仆虫的N端嵌合体的基础上重新构建了N端嵌合体,发现游仆虫的“TASNIKS”区表现出了识别UAA和UAG的特异性,“Y×C××F”没有表现出特异性。本研究认为模体构象和氨基酸位点共同决定eRF1识别密码子的特异性,一定程度上支持了“cavity”模型。
　　其次,蛋白质的翻译后修饰对细胞内大分子的相互作用具有重要的影响。通过预测发现eRF1的N端结构域中,一些序列YGKSSNIKS、SALTSTKER、CEKKYTIDF和NTTLYICDN中丝氨酸和络氨酸被磷酸化的几率很高,之前的研究表明这些位点与终止密码子的识别有关。那么,这些位点的磷酸化对eRF1识别终止密码子的特异性是否具有决定作用呢?通过定点突变的方法将N端的磷酸化位点进行突变,以改变激酶的识别位点,结果表明eRF1的N端结构域中关键模体的磷酸化修饰与终止密码子的识别有一定影响。
　　最后,原核生物蛋白质存在翻译后修饰,而蛋白质磷酸化对细胞内大分子的相互识别和相互作用具有重要的影响。最近的研究也发现eRF1的C端结构域对终止密码子的识别有重要的作用。本实验将含有日本赭纤虫eRF1的C端结构域的蛋白,通过非变性PAGE电泳和Western Blotting实验,证实该结构域在大肠杆菌细胞中被磷酸化。这些结果为进一步研究密码子的重新分配机制和赭纤虫eRF1的C端的磷酸化修饰的主要功能提供了重要线索。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 文献综述

1.1 蛋白质的翻译终止过程

1.2第一类肽链释放因子及其功能

1.3 肽链释放因子与其它蛋白因子的相互作用

1.4 赭纤虫和八肋游仆虫的特点及本课题的研究意义

第二章N端二级结构模体对eRF1识别终止密码子特异性的影响

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4实验结果

2.5讨论

第三章 磷酸化的修饰对终止密码子识别特异性的影响

3.1引言

3.2实验材料

3.3 实验方法

3.4实验结果

3.5讨论

第四章 赭纤虫第一类肽链释放因子C端结构域的磷酸化修饰

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 结果

4.5讨论

总结与展望

参考文献

附录

攻读硕士期间取得的研究成果

致谢

个人简介及联系方式