结肠腺瘤息肉蛋白N端片段影响纤毛形成和细胞粘附的机制研究

摘要

Adenomatous Polyposis Coli，即结肠腺瘤息肉蛋白，简称APC，参与Wnt信号通路、细胞迁移、粘附、细胞极性、染色体正常分离等。纤毛是突出于细胞表面的一种亚细胞结构。纤毛形成受损或结构异常与多种疾病的发生相关。细胞粘附包括细胞间粘附和细胞基质间粘附，是恶性肿瘤始动转移的关键。已有研究表明APC突变与纤毛形成受损和细胞粘附异常相关，但具体机制还不清楚。在多数APC突变的个体中都保留有其N端1至448个氨基酸的片段(命名为APC-N1)，这一片段包括一个寡聚结构域，导致APC同源二聚体结构的形成，从而使蛋白失去活性。本课题主要对 APC-N1片段影响纤毛形成和细胞粘附的机制进行研究，研究内容包括以下几部分：
　　第一部分：首先利用荧光定量 PCR和 Western印迹方法检测了 MDCK-GFP和MDCK-APC-N1稳定细胞株的Hedgehog信号通路中两个主要成员Ptch1和Gli1的表达情况。结果显示，与对照MDCK-GFP细胞相比，MDCK-APC-N1细胞中Ptch1和Gli1的表达上调，表明过表达APC-N1激活Hedgehog信号通路。分别利用RNA干扰技术和抑制剂GAN T61处理 MDCK-APC-N1细胞，发现当Gli1表达量降低时，细胞纤毛形成率显著升高，表明过表达 APC-N1是通过 Hedgehog信号通路影响MDCK细胞纤毛形成。进一步利用 RNA干扰技术敲减 MDCK-APC-N1细胞中β-catenin，发现敲减β-catenin导致Gli1的表达量降低。以上结果表明APC-N1通过β-catenin影响Hed ge ho g信号通路，进而抑制纤毛形成。
　　第二部分：利用荧光定量PCR检测AurA的mRN A表达水平，发现AurA表达上调。分别通过RNA干扰技术和TSA药物处理敲减AurA和抑制HDAC6表达，结果发现当AurA或HDAC6表达降低时，纤毛形成率明显增加，表明过表达APC-N1是通过上调AurA/HDAC6表达而抑制纤毛形成。利用RNA干扰技术敲减Gli1检测AurA和 HDAC6表达变化情况，结果发现Gli1表达降低时，AurA和 HDAC6表达量减少。这些结果表明，过表达APC-N1通过激活Hedgehog信号通路使AurA/HDAC6表达量上调，进而抑制纤毛形成。
　　第三部分：利用细胞间粘附实验、荧光定量PCR、Western印迹检测APC-N1对细胞间粘附和相关粘附分子E-cadherin的影响，结果发现APC-N1降低细胞-细胞间粘附和E-cadherin的表达。利用结晶紫染色、荧光定量PCR、Western印迹检测APC-N1对细胞基质间粘附和相关粘附分子 CD29的影响，结果发现 APC-N1过表达提高细胞-基质间粘附能力和CD29的表达。利用RNA干扰技术敲减β-catenin导致E-cadherin表达上调却对CD29没有明显影响，表明APC-N1通过β-catenin影响E-cadherin的表达。LY294002药物处理MDCK-APC-N1细胞检测E-cadherin和CD29的表达情况，结果显示P-AKT(T308)蛋白水平减少，E-cadherin表达量上调，CD29表达降低。以上结果表明APC-N1通过PI3K/AKT信号通路影响细胞粘附。
　　综上所述，本研究探讨了 APC-N1影响纤毛形成和细胞粘附的机制，结果表明APC-N1通过β-catenin激活 Hedgehog信号通路，进而上调 AurA/HDAC6表达，导致纤毛形成受损；此外，APC-N1通过PI3K/AKT信号通路影响细胞粘附。

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中文摘要

英文摘要

第一章 文献综述

1.1结肠腺瘤息肉蛋白

1.2纤毛

1.3 结肠腺瘤息肉蛋白、Hedgehog信号通路和纤毛

1.4细胞粘附

1.5结肠腺瘤息肉蛋白和细胞粘附

1.6研究目的及意义

参考文献

第二章 APC-N1通过β-catenin 激活Hedgehog信号通路进而抑制纤毛形成

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3实验结果

2.4 讨论

参考文献

第三章 APC-N1通过Hedgehog信号通路调节AurA/HDAC6进而抑制纤毛生长

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

参考文献

第四章 AP C-N1对犬肾细胞MDCK细胞粘附的影响

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

参考文献

结论与讨论

附录1 英文缩略语表

附录2 主要试剂配制

附录3 实验主要仪器设备

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历及联系方式

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