黑豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及活性鉴定

摘要

蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor，TI）是大自然中普遍存在的一类活性物质，有着卓越的抗真菌能力和植物抗病虫功能。其保健功能和在抗癌领域的应用也越来越受到人们的关注，最近发现TI与癌症的发生有很多内在联系。豆类是蛋白酶抑制剂的重要来源，黑豆是豆类的重要组成部分，又是众所周知的健康食品，但以往对于黑豆中胰蛋白酶抑制剂的研究报道有很多空白，因此有必要对黑豆中的胰蛋白酶抑制剂进行深入研究。
　　本文旨在对黑豆中的一种胰蛋白酶抑制剂进行提取、纯化及活性鉴定。
　　方法：黑豆粉碎后经石油醚脱脂，40％-60%的硫酸铵分级沉淀，再经脱盐柱，DEAE-FF阴离子柱、SephacrylTMS-100HR凝胶柱进一步纯化后，经酶活性测定，收集获得目的蛋白。通过SDS-PAGE凝胶电泳和质谱鉴定，确定其相对分子量，并通过福林酚法测定蛋白浓度。
　　对黑豆胰蛋白酶抑制剂理化性质的研究主要包含：温度、pH、金属离子对黑豆胰蛋白酶抑制剂抑制活性的影响；通过Lineweaver–Burk作图法和Dixon作图法，对胰蛋白酶抑制剂进行动力学表征，确定其抑制剂类型和与酶作用强度；黑豆胰蛋白酶抑制剂的生物活性表征主要包括两方面：抑制癌细胞增殖能力的测定和抗真菌活性实验。获得如下结果：
　　1、从黑豆中纯化得到一种具有几丁质酶活性的胰蛋白酶抑制剂（Black soybean trypsin inhibitor，BSTI），经SDS-PAGE和质谱鉴定，其分子量为20.3kD，pI值为4.6，数据库同源性分析显示其与大豆胰蛋白酶抑制剂同源性达49%。并测得其具有几丁质酶活性，活性强度为24.69U/mg。福林酚法测得蛋白浓度为0.409mg/mL。
　　2、BSTI表现出很好的热稳定性，在100℃处理1h其抑制活性依然达到80%以上；BSTI在酸性和中性条件下比较稳定，但在碱性条件下随着pH的增大其稳定性逐渐减弱；Fe3+、Mn2+、Ca2+对BSTI的活性有抑制作用，且Mn2+的抑制效果最明显，而Fe2+、Zn2+、K+、Mg2+对抑制剂的活性有激活作用，且Mg2+的激活能力最强；按Lineweaver-Burk作图法，得到胰蛋白酶与BApNA反应的线性方程y=13867 x+101.1，Km=137.127mmol/L。其Km与BSTI存在并起作用时胰蛋白酶和底物作用Km＇的值相同，可以判断BSTI为非竞争性抑制剂类型；用Dixon作图法，得到BSTI的动力学线性方程y=19725 x+173.57，抑制常数Ki=8.8×10-3mmol/L。Ki远小于Km，说明BSTI具有很强的胰蛋白酶抑制剂活性。
　　3、通过MTT初步筛选发现，当BSTI浓度在0-150μg/mL时对乳腺癌MCF-7细胞的抑制效果不明显，当浓度达到200μg/mL以上时，开始表现出对MCF-7的抑制作用，且具有浓度依赖性；当浓度达250μg/mL表现出对肝癌HepG2细胞的抑制能力，以上结果初步表明BSTI在浓度为250μg/mL以上时，对MCF-7和HepG2细胞的增殖具有一定的抑制作用。
　　通过抗真菌实验检测发现，BSTI对木霉和尖孢镰刀菌的生长有明显的抑制作用。
　　本文提取、纯化出一种黑豆胰蛋白酶抑制剂，并对其进行了酶学特性的测定和生物活性的检验，实验结果为黑豆胰蛋白酶抑制剂的后期开发及其工业化应用积累科研和生产经验。