基于滚环扩增的DNA大分子诱导金纳米粒子的可控自组装

摘要

滚环扩增是一种等温核酸扩增技术，相比于传统的DNA扩增方法而言，滚环扩增技术具有高灵敏性、高特异度、操作方便等特性。本课题基于滚环扩增的原理，通过设计模板DNA和与其部分互补的引物DNA，利用引物DNA的碱基互补配对将模板DNA的两端拉近，再通过DNA连接酶连接形成环状模板DNA。恒温条件下，通过DNA聚合酶催化其扩增出由重复单元构成的长链DNA。并探索了产物形成的影响因素、滚环扩增产物的流变性质和以大分子产物作为模板诱导金纳米粒子进行可控自组装。主要研究内容包括以下几个方面： （1）环状DNA模板的合成和滚环扩增产物影响因素的探究 首先对模板链的合成的进行了探索，利用聚丙烯酰氨凝胶电泳对产物进行了表征，本实验设计的模板链DNA有63个碱基，胶谱图上对应位置有信号存在，证明合成出环状DNA。在滚环扩增实验中探究了反应时间、引物、酶、dNTP对产物的影响，并通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶等对产物进行表征，紫外分光光度计结果显示样品在260nm处有明显DNA特征的吸收峰，且吸收峰260/280约为1.8，证明产物有良好的纯度，凝胶成像的琼脂糖泳道中有较强的光密度，且位置处于标准条带谱图的上端，证明产物DNA具有很大分子量和较高浓度。 （2）对产物DNA流变性的初步探索 滚环扩增产物是由很多重复单元构成的DNA大分子链，类似于高分子的性质。本课题对产物DNA进行了流变性的初步探究，研究了长链DNA的粘温曲线、模量曲线和剪切性质。实验结果表明：单链DNA大分子在溶液中比组装体更容易缠绕、交联在一起，当浓度较大时其溶液性质易被破坏。但是两者的抗剪切性质刚好相反，单链DNA由于相互间的作用力更大，所以能在经历高剪切速率后快速的恢复，粘度基本保持不变；而组装体由于内部主要结构是由氢键构成的，所以易破坏并而难以在短时间内恢复。 （3）大分子产物作为模板诱导金纳米粒子的可控自组装 本文利用滚环扩增产物作为模板来负载AuNPs，构建了三种不同的负载方式，共设计了7条序列不同的互补链。利用巯基与AuNPs的亲和性将AuNPs负载到DNA上，考察了反应物加样顺序、反应时间、反应温度等条件对AuNPs负载情况的影响，利用紫外、凝胶成像、透射电子显微镜等手段进行表征。实验结果表明长短链DNA杂交情况良好，透射电镜结果显示长链DNA负载AuNPs后，AuNPs呈现间隔均匀的线性状态，其紫外曲线也说明了负载AuNPs的长链DNA仍然在溶液中具有较高的纯度和强度。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 课题背景

1.2 核酸适配体的概述

1.3 滚环扩增技术

1.3.1 滚环扩增技术的应用情况

1.3.2 滚环扩增技术具有的优势

1.3.3 滚环扩增技术的前景

1.4 纳米金为免疫标记物的检测技术

1.4.1 纳米金的概述

1.4.2 AuNPs为免疫标记物的应用

1.5 DNA与纳米金自组装简介

1.5.1 DNA纳米结构

1.5.2 基于DNA的金纳米粒子自组装

1.6 研究方法

1.6.1 DNA分子的宏观分析

1.6.2 DNA分子的微观分析

1.6.3 DNA分子的流变性分析

1.7 论文研究内容

第二章 DNA的滚环扩增合成

2.1 实验试剂和实验仪器

2.2 实验部分

2.2.1 环状DNA模板合成

2.2.2 滚环扩增反应合成长链

2.2.3 产物的检测与表征

2.3 实验结果讨论

2.3.1 DNA成环过程结果

2.3.2 滚环扩增过程的条件考察与结果

2.4 产物的原子力显微镜表征

2.5 本章小结

第三章 滚环扩增DNA产物的流变性

3.1 实验背景

3.2 实验仪器与实验步骤

（1）不同反应时间下滚环扩增产物粘温曲线

（2）滚环扩增产物与加入互补链反应后的组装体剪切粘度

（1）对滚环扩增产物的流变曲线研究

（2）单链滚环扩增产物与组装滚环扩增产物的剪切与抗剪切曲线分析

3.4 本章小结

第四章 基于滚环扩增的DNA长单链上AuNPs的自组装

4.1 AuNPs的制备

4.1.1 实验试剂和实验仪器

4.1.2 实验部分

4.1.3 AuNPs制备结果

4.2 DNA与纳米金的自组装

4.2.1 滚环扩增产物与巯基短链DNA的组装

4.2.2 DNA组装体与AuNPs的组装

4.2.3 产物的检测与表征

4.3 实验结果讨论

4.4 本章小结

第五章 基于滚环扩增的DNA双链上AuNPs的自组装

5.1 含粘性末端的DNA与AuNPs的组装

5.1.1 实验过程

5.1.2 实验结果讨论

5.2 含中转-DNA与AuNPs的组装

5.3本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间取得的成果

致谢