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【6h】

鱼类淋巴囊肿病毒核酸检测诊断技术的研究

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文摘

英文文摘

前言

1淋巴囊肿病毒的分离纯化

1.1材料和方法

1.1.1实验材料

1.1.2实验方法

1.2结果

1.3讨论

2淋巴囊肿病毒核酸的提取和酶切图谱分析

2.1材料和方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.2结果

2.3讨论

3淋巴囊肿病毒的PCR检测技术

3.1材料和方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.2结果

3.3讨论

4淋巴囊肿病毒的斑点杂交(Dot-Blot)检测技术和Southern杂交分析

4.1材料和方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验方法

4.2结果

4.3讨论

5淋巴囊肿病毒的原位杂交检测技术

5.1材料和方法

5.1.1实验材料

5.1.2实验方法

5.2结果

5.3讨论

附图

6淋巴囊肿病流行情况的调查

6.1材料与方法

6.1.1实验材料

6.1.2实验方法

6.2结果

6.3讨论

参考文献

附录(试剂的配制)

致谢

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摘要

由淋巴囊肿病毒(Lymphocystisdiseasevirus,LCDV)引起的淋巴囊肿病主要表现为一种慢性皮肤瘤,通常发生于鱼的体表皮肤、鳍等处。目前,该病在世界范围内已感染了包括海水、淡水和半咸水的42科125种以上的鱼类。自从1992年,我国在养殖的石斑鱼、红鱼中发现淋巴囊肿病以来,受感染的鱼类已有真鲷(Pagrosomusmajor)、鲈(Lateolabraxjaponica)、紫红笛鲷(Lutjanusargentimaculatus)和牙鲆(Paralichthysolivaceus)等10余种。淋巴囊肿病是一种慢性疾病,潜伏期长达几个星期,发病后的鱼体外观丑陋,使之丧失商品价值,从而造成严重的经济损失,制约了海水鱼类养殖业的发展。因此,建立淋巴囊肿病的早期检测和诊断技术对控制该病的发生和蔓延显得尤为重要。 在国家自然科学基金项目的资助下,本文建立了淋巴囊肿病毒的核酸检测诊断技术,并开展了该病流行情况的调查。 取青岛市黄岛某养殖场具典型症状的牙鲆体表囊肿,经匀浆机匀浆、冻融三次、手动匀浆、超声波破碎后,通过差速离心和蔗糖密度梯度离心,在37%~40%和47%~50%的蔗糖界面上有折光带形成。经负染,透射电镜观察后发现37%~40%带中病毒粒子较少,杂质较多;47%~50%带中病毒粒子密度大,基本没有杂质,且病毒完整,直径约为230nm。 病毒粒子经蛋白酶K和SDS消化后,用苯酚/氯仿抽提法提取病毒核酸,产量约为2.30μg/μl。病毒基因组DNA用BanⅡ、BglⅡ、ScaⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HincⅡ和BamHⅠ酶切后,形成的片段数目分别为4、11、10、10、6、17和4。以λDNA/HindⅢ酶切片段和DNAMarkerDL2,000作为标准,用Bio-RadQuantityOne软件计算出各酶切片段的分子量,由各酶切片段总和计算出LCDV青岛分离株的基因组DNA大小平均值约为56.0kb,即Mr约为37.0×106D。病毒DNA经HpaⅡ和MspⅠ酶切进行的甲基化分析表明,病毒基因组DNA能被对CpG甲基化修饰不敏感的MspⅠ切开,而不能被CpG甲基化修饰敏感的HpaⅡ切开,由此证明LCDVDNA胞嘧啶5'端高度甲基化。 根据LCDV的主要核衣壳蛋白基因序列(GenBank:AF126405),设计了一步PCR和巢式PCR引物。在根据Primerpremier5.0分析获得的引物退火温度基础上,分别采用在47.0、48.1、49.0、50.2和51.4℃不同的退火温度来进行PCR反应时,二种PCR反应的特异性均没有受到影响,各反应都可从LCDVDNA中扩增出特异性的目的片段,而对健康牙鲆组织DNA呈阴性反应;在不同退火温度下,巢式PCR扩增效率不变,而一步PCR则不同,在退火49.0℃的时候,特异性产物的量最大。将LCDVDNA进行10倍梯度稀释后分别作为模板,一步PCR和巢式PCR灵敏度实验的结果显示:一步PCR可检测出低至1×10-4μg的病毒DNA,而巢式PCR技术,低至1×10-9μg的病毒DNA即可被检出,这说明以上两种PCR检测技术具有高度的特异性和灵敏性。 利用含digoxigenin-11-dUTP的dNTP混和液,通过一步PCR反应合成了地高辛(DIG)标记核酸探针,在此基础上分别建立了斑点杂交(Dot-Blot)检测技术和原位杂交检测技术。通过Dot-Blot检测表明,探针可以特异性地与病毒DNA进行结合,而与健康牙鲆组织DNA的杂交反应呈阴性。将LCDVDNA进行10倍梯度稀释后分别作为模板,Dot-Blot灵敏度实验的结果显示:Dot-Blot的最小检测量为l00ng病毒DNA。经冰冻切片后进行原位杂交检测,在囊肿细胞的细胞质内发现大量的蓝黑色的细胞沉淀物,主要聚集在细胞的边缘部分,石蜡切片后H&E染色确定这些沉淀物为嗜碱性的包涵体,表明通过原位杂交可以在组织细胞内直接定位病毒的原有位置。 LCDV基因组DNA用BanⅡ、BglⅡ、ScaⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HincⅡ和BamHⅠ酶切后,使用DIG标记的核酸探针,对其进行了Southern杂交分析,结果表明:在BanⅡ-A(30.4kb)、BglⅡ-C(8.4kb)、ScaⅠ-A(19.3kb)、EcoRⅠ-A(19.3kb)、PstⅠ-B(19.8kb)、HincⅡ-E(4.0kb)和BamHⅠ-A(28.2kb)酶切片段上,各有一条杂交阳性带。 应用本文建立的PCR和原位杂交两种技术,对淋巴囊肿病流行情况初步调查的结果显示:该病流行范围广,可感染多种鱼类,包括牙鲆(Paralichthysolivaceus)、黑鲪(Sebastodesfuscescens)、纹腹叉鼻鲀(Arothronhispidus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、红头鱼(Lepidoriglamicroptera)和鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)。本研究分析推测,LCDV可通过近海海域野生鱼或由鲜活饵料传染给我国养殖经济、观赏鱼类。在利用PCR技术检测不同地域LCDV时发现,使用韩国检测LCDV引物检测我国北方地区患病牙鲆时,其扩增片段大小与预计不符,而使用本文设计的引物来检测南方病鱼时,也有类似情况发生,这说明各地的LCDV流行株在基因上可能有别并存在一定的基因突变。在对处于不同感染状态的病鱼组织器官检测中,鳃和脾经常是最先被检测出存在LCDV的器官。本研究分析推测,LCDV可能经鳃进入血液循环系统,感染脾后再向各器官传播。

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