高产海藻糖酵母菌株利用玉米淀粉一步转化生产海藻糖的工艺研究

摘要

海藻糖(Trehalose)又名覃糖，在细菌、酵母菌、真菌以及一些昆虫、脊椎动物和植物中广泛存在。研究显示海藻糖不仅可以作为细胞碳源储存物，而且可用作高效保护剂增加细胞组分对不良环境条件(如高温、冷冻、脱水、高渗透压和高酒精浓度)的抗性。海藻糖的这种保护特性使它在许多方面具有广泛的应用，如医学和微生物学中作为细胞防冻剂、作为化妆品的有效成分、作为诊断试剂和生物产品的稳定剂，甚至还可以用作新鲜食品的防腐剂。因此，现在许多人正致力于用廉价的方法生产海藻糖。 淀粉价格低廉，来源广泛，被认为是用来生产海藻糖的最佳原料。Pretorius等报道能够利用淀粉作为碳源和能源的150株酵母菌中，能够表达淀粉液化酶和糖化酶的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)对淀粉的降解效率最高。我们过去的研究中发现Saccharomycopsisfibuligerasdu在淀粉培养基中经48小时发酵海藻糖的累积量达到18.0％(w/w)，说明Saccharomycopsisfibuligera是用来生产海藻糖的很好菌株。但是该酵母菌体内能合成酸性和中性海藻糖酶，这些酶在细胞中可以分解合成的海藻糖，这对海藻糖的累积是不利的。因此，为了提高海藻糖的产量，从该菌株中去除或削弱酸性和中性海藻糖酶活力是必要的。后来，利用化学诱变技术获得酸性和中性海藻糖酶活力大大降低的A11突变株，该突变株在可溶性淀粉培养基中培养菌体内海藻糖的累积量达到19.1％(w/w)。本研究发现用玉米淀粉代替淀粉来生产海藻糖能使海藻糖的生产成本更低，A11突变株在1％(w/v)玉米淀粉培养基中发酵48小时菌体内海藻糖的累积量达到24.0％(w/w)。 本论文利用突变株A11菌株分别用玉米淀粉和可溶性淀粉培养基在摇瓶中发酵，结果发现用玉米淀粉代替可溶性淀粉发酵48小时，该突变株在玉米淀粉培养基中生长后细胞内海藻糖的积累量在要高于在可溶性淀粉培养基中的积累量，比如说在发酵48小时后，突变株在玉米淀粉培养基中其细胞内海藻糖的含量为21％(w/w)，在相同条件下该突变株在可溶性淀粉培养基中培养其细胞内海藻糖的含量为15.8％(w/w)。同时还比较了该突变株在这两种不同培养基中菌体生长情况以及用不同淀粉培养基发酵过程中这两种培养基内还原糖和总糖的变化情况。 本论文还利用2升全自动发酵罐研究该菌株发酵玉米淀粉生产海藻糖的最佳工艺，得出A11菌株积累海藻糖的最佳条件是：培养基初始pH5.5，培养温度30℃，发酵罐转速200rpm，通气量4l/min，最佳碳源浓度为2.0％(w/v)的玉米淀粉，在这种最佳条件下，该突变株转化玉米淀粉可以产生22.89％(w/w)，这是利用玉米淀粉直接转化生产海藻糖最高产量的酵母菌菌株，我们是首次建立了利用玉米淀粉直接经过产淀粉酶酵母菌转化生产海藻糖的工艺。我们发现不影响菌体生长的条件下，低浓度碳源有利于菌体内海藻糖的积累。 在海藻糖提取精制工艺方面，本论文主要用了热蒸馏水提取菌体中的海藻糖，提取液经过进一步分离纯化，得到的海藻糖晶体。

目录

第一章综述

第二章扣囊复膜酵母突变菌株A11菌株转化不同淀粉生藻糖的摇瓶试验

1.材料

1.1.菌株

1.2.培养基

1.3.玉米淀粉

2.方法

2.1.豆饼粉水解液的制备

2.2.A11菌株积累海藻糖的最佳培养基及其浓度的确定

2.3.海藻糖藻的提取和定量测定

2.4.细胞生长量的测定

2.5.还原糖浓度的测定

2.6.总糖浓度的定量测定

3.结果与讨论

3.1.A11菌株在不同淀粉及其不同淀粉浓度培养基中发酵48小时后菌体内海藻糖的积累量

3.2.A11菌株在不同淀粉及其不同淀粉浓度培养基中发酵48小时菌生长

3.3.A11菌株在不同淀粉及其不同淀粉浓度培养基中发酵48小时后发酵液中还原糖的含量

3.4.A11菌株在不同淀粉及其不同淀粉浓度培养基中培养48小时后发酵液中总糖的含量

4.结论

第三章利用2L全自动发酵罐进行玉米淀粉转化成海藻糖的工艺优化

1.材料

1.1.菌株

1.2.培养基

1.3.发酵罐

2.方法

2.1.A11菌株积累海藻糖的最适玉米淀粉浓度试验

2.2.A11菌株积累海藻糖的最适搅拌速度试验

2.3.A11菌株积累海藻糖的最适通气量试验

3.结果与讨论

3.1.A11菌株积累海藻糖的最佳玉米淀粉浓度

3.2.A11菌株积累海藻糖的最佳搅拌速度

3.3.A11菌株积累海藻糖的最佳通气量

4.总结

第四章海藻糖提取工艺

1.材料

1.1.菌种

1.2.培养基

1.3.主要试剂药品

1.4.主要仪器

2.方法

2.1.培养

2.2.提取方法

2.3.超滤澄清

2.4.阴阳离子树脂脱色脱盐

2.5.蒸发浓缩

2.6.冷冻干燥

3.结果与讨论

3.1.海藻糖层析图谱

3.2.紫外扫描图

4.结论

参考文献

硕士期间已发表的文章

致谢