产铁载体海洋普鲁兰类酵母(Aureobasidium pullulans)HN6.2菌株遗传改良的研究

摘要

铁载体是一类铁特异性螯合剂，它是一种小分子量的、对铁离子有高度亲和力的化合物。它在向微生物细胞提供铁元素的过程中起着重要的作用。铁载体通常由细菌、真菌和禾本植物合成，用来从它们的生存环境中寻找并结合铁离子，铁载体可参与生物体细胞外的铁离子转运，络合铁离子后的铁载体还可作为细胞内铁离子的储备物。目前已知，铁载体的生物合成会受到铁离子浓度的影响，当生物体外界环境中的铁离子超过一定浓度范围时，铁载体的合成受到极大的抑制作用。人们已经从各种微生物体内分离鉴定了众多铁载体，按照化学结构将它们分为三大类，即儿茶酚型、氧肟酸盐型和羧酸盐型铁载体。铁载体在医学、农业、核燃料回收、治理金属污染和石油污染中有着巨大的应用潜力。
　　 在本实验室之前的研究中，普鲁兰类酵母(Aureobasidium pullulans)HN6.2是一株从青岛近海海泥中分离得到海洋酵母。它的铁载体产量较高，但在铁载体合成的同时产生大量的胞外多糖，主要是由普鲁兰多糖，对铁载体的生产和提取产生不利的影响。在本研究中，利用化学诱变和基因敲除的方法对普鲁兰类酵母HN6.2进行遗传改良。
　　 利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)对普鲁兰类酵母HN6.2菌株进行诱变，并筛选出一株胞外多糖产量少，铁载体产量提高的突变株HN18。然后利用单因子变量试验的方法，对突变株HN18产铁载体培养基成分和摇瓶培养条件及5升发酵罐条件进行优化，最终确定最优培养基组份为：蔗糖2.5％(w/v)，硝酸铵0.5％(w/v)，磷酸氢二钾0.3％(w/v)，一水合柠檬酸0.1％(w/v)，硫酸镁0.008％(w/v)，硫酸锌0.0002％(w/v)，10 mM的L-鸟氨酸，培养基初始pH值为5.5。最佳摇瓶培养条件为：转速180 rpm，培养温度28摄氏度，培养时间为120 h，在此条件下铁载体产量可达0.24 g/L。在5升发酵罐中的最佳发酵条件为：通气量5L/min，搅拌速度200 rpm，温度28℃，发酵时间时间156 h，在此条件下，铁载体产量最高可达0.51 g/L。
　　 通过构建敲除载体，成功敲除了产铁载体普鲁兰类酵母HN6.2菌株中普鲁兰多糖合成酶基因PUL1，筛选得到了敲除菌株DPS1，与原始菌株相比，该敲除菌株胞外多糖产量明显减少，铁载体产量上升。由于敲除菌株普鲁兰多糖产量的下降，在化学法提取铁载体过程中省略添加乙醇去除普鲁兰多糖的步骤，简化了铁载体的提取流程，达到了预期目的。