氟哌啶醇和南极磷虾油对斑马鱼帕金森病的诱发和保护作用研究

摘要

斑马鱼(Danio rerio)为鲤科、短担尼鱼属的小型硬骨鱼，对相当一部分化学污染物敏感，是国际标准化组织(ISD)以及国家环境保护局推荐作为毒理学试验的标准鱼类模式动物。随着斑马鱼基因组测序工程的完成，发现斑马鱼的基因与人类的基因具有高度同源性，使得斑马鱼作为一种研究人类疾病的模式动物越来越受到人们的关注。帕金森病(PD)是是目前世界第二大神经变性疾病，在65岁以上老年人中患病率高达1％。但目前其致病机理尚未完全掌握，该病仍不能完全治愈，因此对PD动物模型的研究有助于其致病机理和治疗策略的认识加深。
　　本研究以斑马鱼幼鱼和成鱼为研究对象，利用氟哌啶醇诱导斑马鱼PD模型，并探讨了南极磷虾油对斑马鱼成鱼PD模型的神经保护作用。首先考察了氟哌啶醇对斑马鱼胚胎及幼鱼的神经毒性，初步确定了氟哌啶醇诱导斑马鱼PD的可行性；之后进行了氟哌啶醇对成年斑马鱼急性毒性及病理组织学研究，以比较斑马鱼幼鱼与成鱼建立PD的优势，同时确定成年斑马鱼PD氟哌啶醇剂量；最后探讨了南极磷虾油对斑马鱼成鱼PD模型的神经保护作用。
　　收集斑马鱼受精卵，于6孔培养板中分组处理。由于氟哌啶醇微溶于水，实验采用0.01%DMSO助溶，设置正常对照组、DMSO对照组和氟哌啶醇组，氟哌啶醇组浓度分别为0.10,0.20,0.40,0.80和1.60 mg·L-1。培养板置于光照培养箱中孵化，每天定时观察胚胎发育形态，统计孵化率、畸变率和死亡率。免疫组化染色观察氟哌啶醇对4 dpf幼鱼脑部DA神经元的影响，测定7 dpf幼鱼游泳速度。结果发现氟哌啶醇引起斑马鱼胚胎发育迟缓，高浓度引起畸变和死亡；随着氟哌啶醇浓度升高，幼鱼游泳能力下降，并出现僵直、侧翻等PD症状，左旋多巴能够缓解该症状；同时显示氟哌啶醇引起幼鱼脑部DA神经元面积减小。初步提示氟哌啶醇能够用于诱导斑马鱼PD模型。
　　通过预实验确定了5月龄成年斑马鱼急性毒性实验氟哌啶醇浓度0.243,0.300,0.371,0.458,0.566和0.700 mg·L-1。结果显示，氟哌啶醇48 h和96 h LC50分别为0.388 mg·L-1和0.325 mg·L-1，同时氟哌啶醇组斑马鱼表现出僵直、侧翻等运动障碍，类似PD症状；实验结束后对斑马鱼脑、肝脏和肾脏进行HE染色，发现斑马鱼的脑组织损伤较严重，肝脏和肾脏损伤不明显。由于斑马鱼幼鱼个体小，行为学表现不容易观察，对于氟哌啶醇引起的DA神经元损伤不能确定是阻止了神经元的发育还是对已有神经元造成损伤。相比之下，认为诱导斑马鱼成鱼PD模型更为理想。
　　用0.3 mg·L-1氟哌啶醇诱导斑马鱼成鱼PD，通过测定斑马鱼5 min穿过线条数评估斑马鱼的游泳能力，并统计了各组斑马鱼呼吸和皮肤变化。结果显示PD斑马鱼游泳能力下降，并表现出PD典型症状；免疫组化染色显示DA神经元减少。证明氟哌啶醇建立斑马鱼成鱼PD模型较为理想。
　　斑马鱼于Hal中处理48 h表现出典型PD症状后转入100 mg·L-1南极磷虾油中。结果斑马鱼游泳能力得到较显著改善，呼吸与皮肤颜色均有所恢复；免疫组织化学染色显示，斑马鱼DA神经元相比PD组有显著恢复。这初步显示南极磷虾油能够在一定程度上修复受损的DA神经元，对斑马鱼具有神经保护作用。

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第一章 前言

1 斑马鱼概述

2 帕金森病研究概述

3氟哌啶醇概述

4 南极磷虾油

5 立题依据与未来展望

第二章 氟哌啶醇对斑马鱼胚胎及幼鱼的神经毒性研究

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3结果

4 讨论

5 小结

第三章 氟哌啶醇对成年斑马鱼急性毒性及组织病理学研究

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第四章 南极磷虾油对斑马鱼帕金森病的神经保护作用

1实验材料与仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

总结

参考文献

致谢

硕士期间发表的学术论文与研究成果