耐酸真菌次生代谢产物PQ抗甲型流感病毒作用机制研究

摘要

流感病毒是研究最早的病毒之一，它具有发病快，传播迅速的特点，能在极短短时间内造成局部地区的爆发或全球的流行。21世纪以来，流感病毒先后几次大规模流行，如2005年的H5N1禽流感，2009年的甲型H1N1流感以及最近爆发的H7N9甲型流感等。但目前国际上普遍应用的抗甲流的药物主要为离子通道阻断剂(M2 ion channel blockers)和神经氨酸酶抑制剂(NAIs)两种，且现在都已出现病毒耐药性。因此探索针对新靶点的抗甲流药物意义十分重大。
　　细胞的受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase，RTKs）是存在于细胞表面的一系列生长因子的受体，它对调节细胞的生长，代谢和分化有着十分重要的意义。RTK及其下游信号通路与甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)的感染和复制有着密切的联系。因此，通过靶向宿主细胞中的RTKs分子及其下游信号通路来寻找抗甲流药物可以获得新靶点药物，且避开了已有的抗甲流药物易产生病毒耐药性的缺点。
　　本论文的研究对象为来源于云南建水紫陶土的耐酸真菌Penicilliumpurpurogenum JS03-21产生的一种双环酮类的小分子化合物PQ。前期研究发现其具有体外抑制甲型流感病毒的效果。本论文主要从体内外水平上全面探究PQ抗IAV的作用机理，以期为新型抗IAV药物的研发提供理论参考。
　　本论文通过利用MDCK细胞系和PR8毒株建立的体外抗病毒模型对耐酸真菌次生代谢产物PQ的抗病毒效果进行初步的测定。通过检测加入PQ之后的细胞病变抑制率和细胞上清液神经氨酸酶(neuraminidase，NA)活力，评价PQ的抗甲型流感病毒的效果。实验结果表明，加入PQ之后，MDCK细胞的病变率明显降低，NA滴度明显降低，其半数抑制浓度IC50为26.4μg/mL。说明PQ在细胞水平具有良好的抗病毒效果。
　　本论文进一步探究小分子化合物PQ的抗病毒作用机制。利用免疫荧光技术检测PQ不同的作用时间下，病毒核蛋白(nucleprotein,NP)在MDCK细胞中的表达和定位情况。研究结果表明，PQ的加入可能延缓了NP蛋白的入核和出核过程，从而大大降低了病毒的增殖数量。Western blot实验结果表明，PQ能抑制与流感病毒复制相关的RTK通路中相关蛋白的激活，进而抑制流感病毒的复制及炎症反应。
　　本论文还在动物水平探索PQ对IAV感染小鼠的免疫损伤的抑制作用。首先利用昆明小鼠建立小鼠肺炎模型，然后检测PQ对小鼠肺指数，肺病毒滴度及炎性因子含量的影响，并观察小鼠死亡情况。结果表明，PQ作用后，小鼠肺组织中炎性因子的分泌量显著降低，肺部病变明显减轻，肺指数显著降低，生存率大大提高。
　　综上所述，本论文在分子、细胞和动物水平上利用多种技术和方法深入地探讨了耐酸真菌次生代谢产物PQ的抗甲型流感病毒作用机制。研究揭示出PQ是通过抑制与病毒复制相关的RTK通路中蛋白的激活，抑制病毒的复制以及降低机体炎性反应相关的细胞因子的分泌，最终发挥其抗IAV作用。本文阐释了新颖小分子PQ是通过靶向RTK通路激活来发挥抗病毒作用，这与以往研发抗甲型流感病毒药物的思路不同，为新型抗流感药物的研发提供了筛选靶点和理论参考。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．流感病毒的研究概述

1．1 流感病毒的结构与形态

1．2 流感病毒的分类和命名

1．3 甲型流感病毒的致病机理

1．4 甲型流感的防治方法

2 与甲型流感病毒感染相关的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)信号通路的研究简介

2．1 Ras／Raf／MEK／ERK信号通路

2．2 p38 MAPK信号通路

2．3 NF-kB信号通路

3 微生物药用开发

4 论文的研究思路与创新点

第二章 耐酸真菌次生代谢产物PQ体外抑制IAV感染的研究

1 实验仪器与试剂

1．1 实验材料及试剂

1．2 实验仪器及耗材

1．3 主要溶液的配制

2 实验方法

2．1 细胞的复苏与冻存

2．2 细胞的培养

2．3 细胞的传代

2．4 甲型流感病毒的增殖

2．5 甲型流感病毒的毒力测定

2．6 耐酸真菌次生代谢产物PQ细胞毒性测定

2．7 耐酸真菌次生代谢产物PQ细胞水平抗H1N1流感病毒活性测定

2．8 耐酸真菌次生代谢产物PQ对细胞上清中病毒NA含量的影响

3 实验结果及讨论

第三章 耐酸真菌次生代谢产物PQ对于IAV复制相关的RTK信号通路的抑制作用研究

1 实验仪器与试剂

1．1 实验材料及试剂

1．2 实验仪器及耗材

1．3 主要溶液的配制

2 实验方法

2．1 利用western blot研究PQ对于IAV感染后细胞中RTK信号通路蛋白激活的影响

2．2 耐酸真菌次生代谢产物PQ的不同作用时间对其抗H1N1病毒活性的影响

3 实验结果及讨论

第四章 耐酸真菌次生代谢产物PQ对于IAV感染小鼠的免疫损伤的抑制作用研究

1 实验仪器与试剂

1．1 实验材料及试剂

1．2 实验仪器及耗材

2 实验方法

2．1 小鼠免疫损伤模型的构建

2．2 给药和肺指数计算

2．3 肺部病毒滴度的测定

2．4 肺组织病理学观察

2．5 PQ对炎症因子表达的影响

3 实验结果及讨论

第五章 结语

参考文献

个人简历

发表的学术论文

致谢