犬传染性肝炎是由I型腺病毒引起的犬的一种烈性传染病,其发病率和致死率都很高,是危害犬最为严重的疾病之一。迄今为止,该病的诊断方法主要有血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验、间接血凝试验(IHA)、琼脂扩散试验(AGP)、酶标抗体技术、常规PCR等多种方法。这些方法普遍存在特异性差、耗时长、灵敏度低、易出现假阳性等问题,致使病原诊断始终较困难,所以寻找一种快速准确的诊断方法显得尤为重要。 实时荧光PCR技术是一种新型的核酸检测技术,具有极大的应用价值,在临床诊断中已经用于细菌、病毒及遗传性疾病的检测。本研究针对犬传染性肝炎病毒(CAV-I)的保守核苷酸序列设计一对引物,以此引物和CAV-I的标准毒株DNA为模板,建立并优化了SYBR Green I荧光PCR检测犬传染性肝炎病毒的方法,待测样品的检测结果可以根据扩增曲线和Tm值进行判定。把扩增区克隆测序鉴定,其产物长度为100bp,确认设计引物正确,同时并把克隆质粒作为该方法的阳性对照；特异性试验研究表明,只有CAV-I可被特异性扩增,其产物的Tm值为79±0.5℃,而其他干扰毒株均没有典型扩增曲线和熔解曲线；敏感性试验结果显示该方法比常规PCR方法敏感100倍以上,可以全面代替并优于常规PCR方法；本研究还对所建立的试验方法进行了初步应用,用SYBR Green I荧光PCR方法与酶联免疫吸附试验和血凝试验对送检的46个出入境样品进行了检测比对,结果表明该方法更适于出入境犬传染性肝炎的检疫。 该方法与普通PCR相比具有闭管操作、无需后处理、无污染和检测时间短等优点,同时具有高度敏感性,成本低廉,可以作为一种快速检测方法应用。经反复试验和探索,根据本研究方法组装了SYBR Green I荧光PCR检测犬传染性肝炎病毒试剂盒,该试剂盒便于操作、可重复性高,适于在兽医诊断实验室应用推广。
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