表观遗传修饰调控拟南芥离体苗再生的机理研究

摘要

植物具有从己分化的组织或细胞经过脱分化和再分化产生新器官的能力，因此器官再生是种苗快繁和植物遗传工程的基础，也是研究植物生长发育问题的重要系统。表观遗传修饰在动植物生长发育过程中起着重要的调控作用。然而迄今为止，表观遗传修饰调控植物离体器官再生的机理仍不清楚。本研究以拟南芥为材料，分析了DNA甲基化和组蛋白修饰在离体苗再生过程中的调控作用。主要研究结果如下：
　　 1.拟南芥离体苗再生过程中DNA甲基化的状态
　　 利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术对拟南芥离体苗再生过程中CCGG位点的甲基化状态进行分析，结果显示，32.15％的CCGG位点DNA甲基化模式发生改变，其中8.66％发生重新甲基化，17.68％发生去甲基化，表明拟南芥离体苗再生与基因组水平上动态的DNA甲基化有显著的相关性。
　　 2.MET1基因的突变对拟南芥离体苗再生的影响
　　 在苗诱导培养基（SIM）上，相比于野生型愈伤组织，met1突变体更早形成绿色芽点，并且产生更多的离体苗，表明MET1基因的突变促进拟南芥离体苗再生。荧光实时定量PCR（qRT-PCR）结果显示，met1突变体愈伤组织中WUS基因的表达水平上调，推测MET1介导的DNA甲基化可能通过调节WUS基因的表达诱导干细胞形成和离体苗再生。
　　 3.拟南芥离体苗再生过程中WUS基因的DNA甲基化
　　 利用亚硫酸氢盐测序技术检测WUS基因及其5’和3’端大约10kb基因组序列的甲基化状态，结果显示，WUS基因5’和3’端区域发生DNA甲基化。在愈伤组织时期，该区域处于高甲基化水平，在苗诱导培养基（SIM）上培养6天后，甲基化水平降低，表明拟南芥离体苗再生过程中WUS基因5’和3’端区域发生去甲基化。序列分析发现，WUS基因发生甲基化的区域存在转座子元件，并且含有增强子的核心序列，推测动态的DNA甲基化可能通过调节增强子的活性调控WUS基因的转录。
　　 4.拟南芥离体苗再生过程中WUS位点的组蛋白修饰
　　 利用染色质免疫共沉淀（CHIP）技术分析WUS位点的组蛋白修饰，结果显示拟南芥离体苗再生过程中，WUS基因发生甲基化的区域，H3K4me3甲基化水平和H3K9ac乙酰化水平上升，H3K9me2甲基化水平下降，表明动态的组蛋白修饰可能通过影响染色质的结构激活WUS基因的表达。
　　 5.DNA甲基化与激素之间的关系
　　 在拟南芥离体苗再生过程中，DNA甲基化通过直接调控ARF3、IAA18基因的表达调节生长素的信号输出。ARF3直接结合到细胞分裂素合成基因IPT5启动子上抑制该基因在生长素响应区域表达，引起细胞分裂素的区域性分布。细胞分裂素通过其受体AHK4调控WUS基因的表达，诱导干细胞形成和离体苗再生。
　　 6.拟南芥离体苗再生的基因芯片分析
　　 选取未诱导（0天）和苗诱导培养基上生长4天、6天的野生型和met1突变体愈伤组织，利用拟南芥全基因组芯片进行基因表达谱分析，其中314个基因可能参与离体苗再生并受DNA甲基化调控。从中选取与细胞分裂素、生长素、器官发生等相关的基因进行亚硫酸氢盐测序分析，结果显示，5个基因受DNA甲基化的直接调控；8个基因受DNA甲基化的间接调控。进一步地研究发现，ARF3、IAA18及ANT基因的诱导表达促进离体苗的再生，证明这些基因在拟南芥离体苗再生过程中起着正调控作用。
　　 综上所述，动态的DNA甲基化及组蛋白修饰与激素相互作用调控WUS等基因的表达，诱导干细胞形成和离体苗再生，该研究工作为揭示表观遗传修饰调控植物离体器官再生的机理提供了重要信息。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

1 前言

1.1 植物离体苗再生

1.1.1 植物离体苗再生的模式

1.1.2 激素对植物离体苗再生的调控

1.1.3 细胞分裂素对植物离体苗再生的调控

1.1.4 生长素对植物离体苗再生的调控

1.1.5 离体苗再生过程中细胞分裂素和生长素的相互作用

1.1.6 分生组织发育相关基因对植物离体苗再生的调控

1.2 植物干细胞

1.2.1 植物干细胞的组织学特征

1.2.2 植物苗端分生组织干细胞调控的分子机制

1.2.3 植物根端分生组织干细胞调控的分子机制

1.2.4 植物干细胞的表观遗传调控

1.3 表观遗传调控

1.3.1 表观遗传学的起源与发展

1.3.2 表观遗传学与遗传学

1.4 DNA甲基化

1.4.1 DNA甲基化的建成

1.4.2 DNA甲基化的维持

1.4.3 DNA的去甲基化

1.4.4 DNA甲基化与基因表达调控

1.4.5 DNA甲基化与植物激素的关系

1.5 组蛋白的修饰

1.5.1 组蛋白的甲基化

1.5.2 组蛋白的乙酰化

1.6 表观遗传修饰间的相互作用

1.6.1 DNA甲基化与组蛋白乙酰化之间的相互作用

1.6.2 DNA甲基化与组蛋白甲基化之间的相互作用

1.6.3 组蛋白修饰之间的关系

1.7 表观遗传修饰与环境因素

1.8 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料及生长条件

2.1.2 菌株和质粒

2.1.3 酶及生化试剂

2.1.4 PCR引物

2.1.5 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 拟南芥再生离体苗的培养

2.2.2 DNA的甲基化敏感扩增多态性（MSAP）分析

2.2.3 基因组DNA的亚硫酸氢盐测序分析

2.2.4 染色质免疫共沉淀

2.2.5 表达载体的构建

2.2.6 农杆菌介导的拟南芥遗传转化

2.2.7 石蜡切片的制备和观察

2.2.8 共聚焦显微镜观察和图像处理

2.2.9 拟南芥基因芯片分析

2.2.10 qRT-PCR

3 结果与分析

3.1 拟南芥离体苗再生过程中DNA甲基化状态的变化

3.1.1 CCGG位点的甲基化状态分析

3.1.2 拟南芥离体苗再生过程中CCGG位点的甲基化模式分析

3.2 MET1基因突变对拟南芥离体苗再生的影响

3.2.1 met1突变体离体苗再生频率的统计学分析

3.2.2 met1突变体离体苗再生的形态学观察

3.2.3 met1突变体离体苗再生的组织学分析

3.3.MET1基因突变对WUS基因表达的影响

3.4.拟南芥离体苗再生过程中WUS基因的甲基化状态

3.5 WUS基因甲基化区域的序列分析

3.6 WUS基因表达与组蛋白修饰的关系

3.6.1 WUS基因表达与H3K4me3和H3K9me2的关系

3.6.2 WUS基因表达与H3K9ac的关系

3.7 DNA甲基化和激素在拟南芥离体苗再生过程中的关系

3.7.1 细胞分裂素对于met1突变体愈伤组织离体苗再生的影响

3.7.2 拟南芥离体苗再生过程中met1突变体对于细胞分裂素的响应

3.7.3 拟南芥离体苗再生过程中细胞分裂素响应基因的表达模式分析

3.7.4 拟南芥离体苗再生过程中MET1与AHK4基因之间的关系

3.7.5 拟南芥离体苗再生过程中MET1基因的表达模式分析

3.7.6 激素对于WUS基因转录水平和甲基化状态的影响

3.8 拟南芥离体苗再生的基因芯片分析

3.8.1 参与离体苗再生并受DNA甲基化调控基因的筛选和GO分析

3.8.2 候选基因的qRT-PCR验证及亚硫酸氢盐测序分析

3.8.3 拟南芥离体苗再生过程中候选基因的功能分析

4 讨论

4.1 拟南芥离体苗再生过程中DNA甲基化状态发生改变

4.2 动态DNA甲基化调控WUS基因的表达

4.3 WUS基因表达的染色质水平调控

4.4 拟南芥离体苗再生过程中DNA甲基化和激素之间的关系

4.4.1 DNA甲基化调控生长素的信号输出

4.4.2 激素对DNA甲基化的影响

4.5 DNA甲基化及组蛋白修饰调控拟南芥离体苗再生的初步模型

4.6 ARF3,IAA18和ANT基因的诱导表达促进离体苗的再生

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况