同时定量蛋白质组与磷酸化蛋白质组揭示Paenibacillus polymyxa SC2形态分化的分子机制

摘要

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）广泛用于农业，因为它促进植物生长和多种特定抗菌物质的合成。然而在培养过程中发现，P.polymyxaSC2发生形态分化，分离出突变株M2-SC2。研究发现，与野生型相比，突变菌株这些方面都发生了很大的变化，包括：与运动性相关的鞭毛，细菌的休眠体芽孢的形成，菌落形态，多聚半乳糖、多聚果糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺等多糖物质合成，真菌病原菌和细菌病原菌的拮抗能力，生物膜形成，细菌本身对营养体的利用能力等。这导致P.polymyxaSC2在应用中不稳定。 目前，大规模蛋白质组学方法已在一些原核生物中鉴定出蛋白质磷酸化位点，如丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸。在这里，本研究使用串联质谱（tandem mass tag，TMT）来量化在形态分化情况下的P.polymyxaSC2中蛋白质和丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸磷酸化的变化，共鉴定得到蛋白质总数2487个。富集磷酸化肽段后鉴定到354个磷酸化位点（分布在795个蛋白质中）。与野生型相比，突变株M2-SC2具有462个差异表达的蛋白质和95个不同修饰水平的磷酸肽。这些数据表明，形态分化导致很多蛋白质的表达差异，并伴随着Ser/Thr/Tyr磷酸化的蛋白质的变化，通常在很多位点，跨越很多的代谢途径，从而影响生物学事件，包括细胞活力，细胞壁的合成和抗生素的合成。 结果表明，形态分化导致P.polymyxaSC2细胞壁变薄，荚膜增厚，细胞活力降低和Fusaricidins合成减少。文章首次报道了DegU和AbrB3协同调节fus基因簇的表达，而DegU可能是一个正调节器，AbrB3是一个负调节器。本研究的结果提供了迄今为止最多的P.polymyxa蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析数据。本文构建了一种可行的策略来增加P.polymyxa的细胞活力和抗生素产生。 同时，定量蛋白质组和磷酸化蛋白质组的数据将为信号转导和基因转录调控的全系统建模提供有用的观点，为研究形态分化与生物学功能之间的关系提供了有效方式。也为进一步应用于代谢工程和农作物的病原菌的生物防治提供思路。这些数据除了反应细胞形态分化对P.polymyxa中蛋白质表达和Ser/Thr/Tyr蛋白质磷酸化状态影响，还将作为进一步研究P.polymyxa中信号转导途径以及更广泛地在原核生物中进一步研究的重要资源。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 多粘类芽孢杆菌概述

1.2 形态分化概述

1.3 蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的应用

1.4 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1 引物

2.2 菌株,质粒和培养基

2.3 蛋白质提取

2.4 SDS-PAGE分离

2.5 FASP消化

2.6 TMT标记

2.7 高pH反相的肽分馏

2.8 磷酸肽富集

2.9 HPLC

2.10 LC-MS/MS分析

2.11 实验设计与统计分析

2.12 数据库检索和生物信息学分析

2.12.1 数据库检索

2.12.2 GO功能注释

2.12.3 蛋白质聚类分析

2.12.4 蛋白质相互作用网络分析

2.13 5'RACE实验

2.13.1 引物的设计及序列

2.13.2 目的基因第一链cDNA的合成

2.13.3 末端加多聚C

2.13.4 PCR第一轮扩增

2.13.5 PCR第二轮扩增

2.13.6电泳检测

2.14 生长曲线和活细胞计数

2.15 活/死细胞染色及鉴别

2.16 透射电子显微镜（TEM）分析超微结构

2.16.1 TEM取材

2.16.2细胞的处理及透射电子显微镜观察

2.17 抗真菌活性测定

2.18 fus基因簇的启动子活性分析

2.18.1 PCR反应体系

2.18.2 质粒pHY300PLK

2.19 表达载体的构建和蛋白纯化

2.19.1 表达载体pET30a-DegU,pET30a-DegS,pET30a-AbrB的构建

2.19.2 定点突变载体pET30a-DegUT239A的构建

2.19.3 蛋白表达及纯化

2.20 凝胶迁移实验（EMSA）

2.20.1 EMSA胶（非变性聚丙烯胺凝胶）的配制

2.20.2 EMSA结合反应

2.20.3 EMSA实验故障排除

3 结果与分析

3.1 蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学共同定量结果

3.2 差异蛋白质和磷酸化蛋白质的功能表征和注释

3.3 全细胞差异的蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析及交互网络构建

3.4 形态分化影响细胞活力和细胞壁的形成

3.5 磷酸化位点的序列Motif和“分子开关”DegU分析

3.6 DegU和AbrB3协同调节Fusaricidin的表达

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

附录1 质谱（MS）分析鉴定的PrkC磷酸化位点

附录2 TMT定量蛋白组学分析的差异蛋白

附录3 通过LC-MS/MS鉴定的蛋白质中的磷酸化肽段

致谢