Akt对CSN6的上调作用及Akt-CSN6轴对NSCLC恶性生长的影响

摘要

研究背景：
　　 CSN6是近几年受到关注的致癌蛋白，在细胞周期及细胞凋亡的调节中发挥重要作用，其在乳腺癌、甲状腺癌、肺癌等多种肿瘤中高表达，和肿瘤的发生密切相关。CSN6的主要功能为通过调控蛋白质的泛素化而调节蛋白质的稳定性，从而影响蛋白质的功能。文献报道，CSN6对MDM2-p53轴及COP1-14-3-3σ轴有重要的调节作用，并由此促进肿瘤的发生。人体内CSN6的蛋白水平和肿瘤的发生有密切关系，但其上游分子目前尚不清楚。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，为人体内重要的肿瘤调节因子，对多种下游分子起调节作用，其在EGF、IGF等生长因子传导通路上发挥重要作用，与肿瘤发生密切相关。尽管目前对Akt的研究颇多，但对其下游分子并未完全了解。Akt与CSN6同为细胞周期、MDM2-p53轴和DNA损伤反应的调节因子，但两者的关系目前尚不清楚，既往有研究提示Akt可能对CSN某些亚复合体有调节作用，但具体哪个亚单位，并不清楚。我们用NetPhos algorithm(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)系统比对出CSN6具有Akt激酶的磷酸化模序，因此推测Akt可磷酸化CSN6，但此尚需要大量的实验来证实。
　　 研究目的：
　　 1.探讨Akt激酶是否对CSN6蛋白水平有调节作用。
　　 2.探讨Akt激酶对CSN6水平调节的机制。
　　 3.探讨Akt-CSN6轴对非小细胞肺癌(NSCLC)恶性生长的影响。
　　 材料及方法：
　　 1.Akt激酶过表达对外源性CSN6水平的影响
　　 对293T细胞，共转染GFP-CSN6及不同浓度的HA-Akt质粒，48小时后对细胞进行GFP荧光检测及收集蛋白进行Western Blot实验。
　　 2.Akt激酶过表达对内源性CSN6水平的影响
　　 选择Rat-1细胞，建立Akt稳定转染细胞株(Rat-1 Akt细胞株)及空载体稳定转染细胞株(Rat-1细胞株)，收集蛋白，进行Western Blot，比较两组细胞CSN6蛋白的含量。
　　 3.抑制Akt激酶活性对CSN6水平的影响
　　 选择MDA-MB453细胞，建立阳性负调节突变型Akt(Dominant Negative Akt，DN-Akt)稳定转染细胞株(MDA-MB453 DN-Akt细胞株)及空载体稳定转染细胞株(MDA-MB453)，收集蛋白，进行Western Blot，比较两组细胞CSN6蛋白的含量。对293T细胞，共转染Flag-CSN6及HA-Akt质粒，同时用PI3K抑制剂LY294002(终浓度50μM)处理细胞，6小时后，检测CSN6蛋白含量，比较用药组及对照组CSN6蛋白的水平。
　　 4.Akt激酶对CSN6核转位的影响
　　 对U20S细胞，共转染GFP-CSN6及HA-Akt质粒，72小时后，用免疫荧光实验检测GFP-CSN6亚细胞内分布情况。同样方法，观察Rat-1-Akt细胞CSN6亚细胞分布情况。
　　 5.Akt激酶对CSN6蛋白降解率的影响
　　 对293T细胞，共转染GFP-CSN6和HA-Akt质粒，24小时后，加蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)(终浓度60μg/ml)培养，分别于加药后1、2及4小时，收集细胞，进行Western Blot，检测CSN6蛋白含量。用Image J软件计算CSN6蛋白降解率。
　　 6.Akt激酶对CSN6泛素化的影响
　　 对293T细胞，共转染GFP-CSN6、HA-ubiquitin及不同浓度的HA-Akt质粒，6小时后加入蛋白酶体抑制剂MG132培养，转染48小时后收集细胞，提取蛋白，每组取1g蛋白(500μl蛋白提取物)用抗GFP抗体进行免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)，用抗泛素抗体对免疫沉淀物进行Western Blot，以测定CSN6泛素化水平。
　　 7.Akt激酶与CSN6蛋白的结合
　　 构建Flag-CSN6-全长片段(Full-length CSN6)、Flag-CSN6-N端片段(氨基酸41-171)(N terminus ofCSN6)及Flag-CSN6-C端片段(氨基酸194-321)(C-terminus ofCSN6)质粒，将3种片段的质粒分别与HA-Akt质粒共转染293T细胞，48小时后，收集细胞，每组细胞取2g蛋白(500μl蛋白提取物)进行免疫共沉淀，用抗-Flag抗体进行免疫沉淀，用抗HA抗体对免疫沉淀物进行WesternBlot，检测Akt激酶和CSN6蛋白的结合状态。
　　 8.Akt激酶磷酸化CSN6
　　 构建能在大肠杆菌中高表达蛋白的pET-Flag-CSN6-WT及pET-Flag-CSN6-S60A质粒，提取Flag-CSN6-WT及Flag-CSN6-S60A重组蛋白，配制激酶反应体系，用同位素法进行Akt激酶体外激酶活性测定，检测加入Akt激酶后各组CSN632P的放射活性。
　　 9.Serine60突变后Akt激酶对CSN6水平、降解率及泛素化的影响
　　 (1)构建myc-CSN6野生型质粒，并用QuickChange定点突变系统获得myc-CSN6 S60A突变型和myc-CSN6 S60D突变型质粒。
　　 (2)对293T细胞共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型和myc-CSN6 S60D突变型质粒及HA-Akt质粒，48小时后收集蛋白，进行WesternBlot，检测各组CSN6含量。
　　 (3)对293T细胞共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型及myc-CSN6 S60D突变型质粒及HA-Akt质粒，24小时后加入Cycloheximide(终浓度60μg/ml)培养，分别于处理后1、2、4小时，收集细胞，进行Western Blot，检测CSN6蛋白降解率。
　　 (4)对293T细胞，共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型及myc-CSN6 S60D突变型质粒及HA-Akt质粒，6小时后加入蛋白酶体抑制剂MG132，转染48小时后收集细胞，用抗myc抗体进行免疫沉淀，用抗泛素抗体对免疫沉淀物进行Western Blot，以测定CSN6泛素化水平。
　　 10.Akt激酶对CSN6转录水平的影响
　　 对293T细胞共转染GFP-CSN6及不同浓度的HA-Akt质粒，48小时后收集RNA，逆转录为cDNA后进行实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)，测定CSN6mRNA水平，以GAPDH作为内参，用相对定量法的2-△△CT值比较组间表达的差异。
　　 11.Akt激酶对CSN6介导的MDM2及p53降解的影响
　　 对非小细胞肺癌A549细胞，共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型及myc-CSN6 S60D突变型质粒及HA-Akt质粒，48小时后收集蛋白用抗-MDM2及抗p53抗体进行Western Blot，检测MDM2及p53蛋白水平。
　　 12.Akt激酶对CSN6介导的NSCLC细胞DNA损伤的影响
　　 对HCT116细胞，转染野生型CSN6，测定细胞内反应氧自由基(ROS)及7-H2AX水平变化，此外，在转染的同时加入LY294002处理，重复上述测定。
　　 13.Akt激酶对CSN6介导的NSCLC细胞增殖能力的影响
　　 对非小细胞肺癌A549细胞，共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型及myc-CSN6 S60D突变型质粒及HA-Akt质粒，24小时后，将细胞分别接种到6孔及96孔板，分别进行MTS实验、平板集落形成实验及软琼脂非锚定依赖性克隆形成实验，检测Akt激酶对CSN6介导的NSCLC细胞恶性生长能力的影响。
　　 14.肺癌组织Akt激酶与CSN6蛋白表达的相关性
　　 选择非小细胞肺癌患者肺癌组织芯片，两张芯片共有40例配对的肺癌组织，用免疫组化LSA法分别检测CSN6及P-Akt(473)表达水平，使用H-score半定量法判定信号的强弱，分析CSN6与P-Akt(473)蛋白水平的相关性。
　　 实验结果
　　 1.Akt激酶对CSN6水平的影响
　　 (1)Akt激酶过表达上调外源性CSN6水平：293T细胞，共转染GFP-CSN6及不同浓度的HA-Akt质粒后，Western Blot及GFP荧光检测均显示加入Akt后，293T细胞内CSN6水平明显增加，且随着Akt浓度的升高而逐渐增加。
　　 (2)Akt激酶过表达上调内源性CSN6水平：高表达AKT的Rat-1 Akt细胞稳定株(Rat-1-Akt)CSN6水平明显高于对照组Rat-1细胞株的CSN6含量。
　　 (3)抑制Akt激酶活性下调CSN6水平：MDA-MB453-DN-Akt细胞CSN6水平明显低于对照组MDA-MB453细胞株。293T细胞受PI3K抑制剂LY294002处理后，CSN6水平明显降低。
　　 (4)肺癌组织Akt激酶与CSN6蛋白的表达相关：40例非小细胞肺癌组织中，P-Akt高表达的23例，其中CSN6高表达的为15例(65.22％)，低表达的为8例(34.78％)；P-AKT低表达的17例，其中CSN6高表达的为5例(29.41％)，低表达的为12例(70.58％)，经卡方检验，两组比较差别有统计学意义，说明CSN6的表达水平与P-Akt(473)的表达水平明显正相关。
　　 2.Akt激酶对CSN6核转位的影响
　　 U2OS细胞共转染GFP-CSN6及不HA-Akt质粒后，免疫荧光检测显示加入Akt组CSN6亚细胞分布由细胞浆向细胞核内转移，同样AKT稳定转染的Rat-1细胞CSN6亚细胞也分布发生由浆到核的转移。
　　 3.Akt激酶对CSN6蛋白降解率的影响
　　 293T细胞，共转染GFP-CSN6及HA-Akt质粒并用并加蛋白合成抑制剂Cycloheximide处理1、2、4小时后，CSN6蛋白降解率测定显示：转染Akt组CSN6蛋白的降解速度较未转染组明显减慢，而MDA-MB453-DN-Akt细胞CSN6蛋白降解速度较未转染组明显加快，Image J软件计算结果显示0、1、2及4小时CSNA6/Vector组蛋白降解率分别为100％，50％，55％及0，而CSN6/HA-Akt组分别为100％，110％，100％及95％，说明Akt激酶可抑制CSN6蛋白的降解。
　　 4.Akt激酶对CSN6泛素化的影响
　　 293T细胞共转染GFP-CSN6、HA-ubiquitin及不同浓度的HA-Akt质粒后，加入Akt组293T细胞内CSN6泛素化水平明显降低，且随着Akt浓度的增加而降低更明显。说明Akt激酶可抑制CSN6的泛素化。
　　 5.Akt激酶与CSN6蛋白的结合
　　 293T细胞共转染HA-Akt及Flag-CSN6-全长片段、Flag-CSN6-N端片段及Flag-CSN6-C端片段质粒后，免疫共沉淀结果显示，Akt激酶和CSN6蛋白直接结合在一起，而与C端片段相比，与N端片段具有更明显的结合能力。
　　 6.Akt激酶磷酸化CSN6
　　 同位素体外激酶活性测定结果显示加入Akt激酶组的CSN6显示32P的放射活性，而未加入Akt激酶的CSN6无放射活性，说明Akt激酶可磷酸化CSN6蛋白。
　　 7.Akt激酶磷酸化CSN6的位点为Serine60
　　 (1)同位素体外激酶活性测定实验结果显示：加入Akt激酶后，CSN6 S60A突变型组的CSN632P放射活性明显低于野生型CSN6组，说明CSN6的S60位点是Akt激酶的作用位点之一。
　　 (2)293T细胞共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型及myc-CSN6S60D突变型质粒及HA-Akt质粒后，细胞内CSN6水平测定结果显示：myc-CSN6S60D突变型组CSN6水平明显增高，myc-CSN6野生型组次之，CSN6 S60A突变型组无明显改变。
　　 (3)293T细胞，共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型及myc-CSN6S60D突变型质粒及HA-Akt质粒后，细胞内CSN6蛋白降解率测定结果显示：myc-CSN6 S60D突变型组CSN6的降解明显减慢，myc-CSN6野生型组次之，CSN6 S60A突变型组无明显改变。
　　 (4)293T细胞，共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型及myc-CSN6S60D突变型质粒及HA-Akt质粒后，CSN6泛素化水平测定结果显示：myc-CSN6-S60D突变型组CSN6泛素化水平明显减低，myc-CSN6野生型组次之，CSN6 S60A突变型组无明显改变。
　　 8.Akt激酶对CSN6转录水平的影响
　　 293T细胞共转染GFP-CSN6及不同浓度的HA-Akt质粒后，结果显示加入Akt组293T细胞内CSN6 mRNA水平增加，且随着Akt浓度的增加而逐渐增加，说明Akt激酶对CSN6的转录也有一定的促进作用。
　　 9.Akt激酶对CSN6介导的MDM2及p53降解的影响
　　 A549细胞共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型及myc-CSN6S60D突变型质粒及HA-Akt质粒后，MDM2及p53水平测定结果显示myc-CSN6S60D突变型组MDM2水平明显增高，myc-CSN6野生型组次之，CSN6 S60A突变型组改变不明显。myc-CSN6 S60D突变型组p53蛋白水平明显降低，myc-CSN6野生型组次之，myc-CSN6 S60A突变型组无明显改变。
　　 10.Akt激酶对CSN6介导的NSCLC细胞DNA损伤的影响
　　 HCT116细胞转染野生型CSN6后，γ-H2AX点数较对照组明显增加，而当转染的同时加入LY294002后γ-H2AX点数较对照组明显减少。
　　 HCT116细胞转染野生型CSN6后，DCF测定结果显示转染CSN6的细胞ROS形成率明显较对照组增加，而当转染的同时加入LY294002后ROS形成率较未加LY294002组明显减少。
　　 11.Akt激酶提高CSN6介导的NSCLC细胞增殖能力
　　 非小细胞肺癌A549细胞共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型及myc-CSN6 S60D突变型及HA-Akt质粒后，MTS测定结果显示myc-CSN6S60D突变型组细胞增殖率明显增高，myc-CSN6野生型组次之，CSN6 S60A突变型组无明显改变，三组间比较差异有统计学意义。说明Akt激酶对CSN6介导的NSCLC细胞增殖能力具有提高作用。
　　 12.Akt激酶提高CSN6介导的NSCLC细胞平板集落形成能力
　　 非小细胞肺癌A549细胞共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型及myc-CSN6 S60D突变型质粒及HA-Akt质粒后，平板集落形成实验结果显示myc-CSN6 S60D突变型组细胞集落形成率明显增高，myc-CSN6野生型组次之，CSN6 S60A突变型组无明显改变，三组间比较差异有统计学意义。说明Akt激酶对CSN6介导的NSCLC细胞非密度依赖生长能力具有提高作用。
　　 13.Akt激酶提高CSN6介导的NSCLC细胞软琼脂集落形成能力
　　 非小细胞肺癌A549细胞共转染myc-CSN6野生型、myc-CSN6 S60A突变型及myc-CSN6 S60D突变型质粒及HA-Ala质粒后，软琼脂非锚定依赖性克隆形成实验结果显示CSN6 S60D突变型组细胞软琼脂非锚定克隆形成率明显增高，CSN6野生型组次之，CSN6 S60A突变型组无明显改变，三组间比较差异有统计学意义。说明Akt激酶对CSN6介导的NSCLC细胞非锚定依赖性生长能力具有提高作用。
　　 结论：
　　 1.Akt激酶抑制CSN6的降解，上调CSN6水平。
　　 2.Akt激酶抑制CSN6降解的机制为，Akt激酶与CSN6结合，磷酸化CSN6，使CSN6的泛素化降低。
　　 3.Akt激酶磷酸化CSN6的位点为Serine60。
　　 4.Akt激酶促进CSN6对MDM2的上调作用及对p53的下调作用。
　　 5.Akt激酶促进CSN6介导的DNA损伤及NSCLC细胞的恶性生长。