阿托伐他汀及其诱导的树突细胞疫苗治疗神经免疫性疾病的潜能研究

摘要

研究背景:实验性自身免疫性神经炎(Experimentalautoimmuneneuritis，EAN)是一种主要由CD4+T细胞介导的、累及外周神经系统(peripheralnervoussystem，PNS)的急性炎症性脱髓鞘性疾病，是目前公认的研究人类格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome，GBS)的理想动物模型。通过免疫同种抗原可以在易感动物中成功地诱导EAN的发生。
　　 他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的抑制剂，可以通过甲羟戊酸途径抑制胆固醇的生物合成，在临床上主要用于治疗高胆固醇血症。目前越来越多的研究表明他汀类药物具有免疫调节的作用。而且他汀类药物的免疫调节作用是多效的，如可以抑制T细胞的活化、增殖和迁移等，并且越来越受到人们的关注。研究报道称，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE）中，阿托伐他汀能够促进T细胞反应从促炎的Thl型向抗炎的Th2型转化。近年来研究发现，IL-17在自身免疫性疾病的发展中起着重要的作用。在复发-缓解型多发性硬化的病人中，辛伐他汀能够直接抑制CD4+T细胞中IL-17的分泌。由此可见，在自身免疫性疾病中他汀类药物可以抑制Th1和Th17型细胞的炎症反应。除此以外，他汀类药物还可以抑制抗原递呈细胞(antigenpresentingcells,APCs)如树突状细胞和B细胞的成熟和功能。阿托伐他汀或洛伐他汀能够抑制人类树突状细胞表面共刺激分子如CD40、CD83、CD86和人类白细胞相关抗原-DR(humanleukocyteantigen-DR,HLA-DR)的表达，进而降低其诱导T细胞增殖的能力。他汀类药物还可以抑制经IFN-γ刺激的人类巨噬细胞和内皮细胞表面主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)的表达，同时还能降低这些细胞活化T细胞的能力。另外，阿托伐他汀还能够增加人类外周血单个核细胞中CD4+CD25high和CD4+CD25+Foxp3+细胞的数量。
　　 综上所述，他汀类药物在动物及人类自身免疫性疾病中有了一定的研究，但到目前为止，还没有关于阿托伐他汀对EAN或人类GBS免疫调节作用的相关报道。基于之前的研究，我们推测阿托伐他汀可以通过免疫调节作用进而改善EAN大鼠的临床症状。因此，我们在EAN大鼠发病的起始阶段开始给予阿托伐他汀治疗，并探讨其对EAN大鼠免疫调节作用的机制。
　　 研究目的:探讨阿托伐他汀诱导实验性自身免疫性神经炎免疫耐受的机制。
　　 研究方法:
　　 1.EAN模型的建立及临床评分
　　 采用健康、雌性Lewis大鼠，将BPM溶于H37Ra株热灭活结核杆菌和不完全弗氏佐剂中，双后足垫皮下注射免疫大鼠，每只大鼠用量为200μl。注射当天定为0天，采用双盲法观察，每日称重并观察大鼠的症状进行临床评分，直至免疫后第18天。
　　 2.阿托伐他汀治疗EAN大鼠
　　 将大鼠随机分为10mg/kg治疗组、1mg/kg治疗组和DMSO对照组。治疗组于免疫后第5天开始每天腹腔注射不同剂量的阿托伐他汀溶液，直至免疫后第18天。对照组给予腹腔注射相同体积的DMSO。
　　 3.组织病理学检测
　　 处死大鼠后取坐骨神经，10％多聚甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，依次经脱蜡、水化、苏木素染色、0.5％伊红液染色、脱水、透明、封片。显微镜下观察坐骨神经中炎性细胞的浸润情况并计数。
　　 4.免疫组化检测
　　 大鼠坐骨神经石蜡包埋后切片，常规脱蜡、水化，EDTA抗原修复，3％H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，滴加兔抗大鼠IFN-γ抗体和兔抗大鼠IL-17抗体4℃过夜。洗涤后滴加HRP标记的山羊抗兔IgG抗体，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜下观察大鼠坐骨神经中阳性细胞的情况并计数。
　　 5.淋巴结单个核细胞(mononuclearcells，MNC)的制备
　　 大鼠麻醉后，无菌条件下取出EAN大鼠腹股沟淋巴结，在无菌滤网上研磨制备成MNC悬液并计数，调整细胞浓度为2×106个细胞/ml。
　　 6.淋巴结MNC表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ的流式检测
　　 取制备好的MNC悬液，分别加入PE标记的CD80抗体、FITC标记的CD86和MHC-Ⅱ单克隆抗体，混匀后4℃条件下孵育30min，洗涤后流式分析测定MNC表面不同分子的表达情况。
　　 7.流式检测Treg细胞的情况
　　 取制备好的淋巴结MNC悬液，加入FITC标记的CD4抗体和PE标记的CD25抗体4℃下孵育30min。洗涤后加入固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)并混匀，4℃下避光孵育过夜。洗涤细胞后加入PE-Cy5标记的Foxp3抗体4℃孵育30min。重悬细胞后上机检测。
　　 8.ELISA测细胞培养上清中细胞因子的水平
　　 经BPM刺激的淋巴结MNC培养60h后，留取上清。按照ELISA试剂盒说明书进行操作检测细胞因子IFN-γ和IL-17的表达水平。
　　 9.统计学分析
　　 应用SPSS17.0软件对资料进行统计分析，应用单因素方差分析(one-factoranalysisofvariance，ANOVA)进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义，结果以均值±标准差(standarddeviation，SD)表示。
　　 研究结果:
　　 1.各组大鼠的发病情况与临床评分
　　 与对照组相比，阿托伐他汀10mg/kg和1mg/kg治疗均延迟了EAN大鼠的发病时间，而且明显地改善了高峰期EAN大鼠的临床症状。而且10mg/kg治疗组和对照组EAN大鼠的发病起始时间相比具有明显差异。从免疫后第13天到17天，与DMSO对照组相比，10mg/kg治疗组的大鼠显示了更低的临床评分，1mg/kg治疗组的大鼠也显示了较低的临床评分，但仅在免疫后第16天其临床评分与对照组相比具有统计学差异。
　　 2.各组大鼠坐骨神经中炎性细胞浸润的情况
　　 与DMSO对照组相比，10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组大鼠坐骨神经中均可见较少的炎性细胞。另外，10mg/kg治疗组与1mg/kg治疗组相比坐骨神经中可见更少的炎性细胞浸润。
　　 3.阿托伐他汀抑制了EAN大鼠坐骨神经中IFN-γ和IL-17的产生
　　 与DMSO对照组相比，10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组大鼠坐骨神经中IFN-γ+和IL-17+细胞数量均明显降低了。10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组相比，坐骨神经中IFN-γ+细胞的数量无明显差异。而10mg/kg治疗组大鼠坐骨神经中比1mg/kg治疗组大鼠坐骨神经中可见更少的IL-17+细胞。进一步的分析表明，10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组大鼠坐骨神经中IFN-γ+和IL-17+细胞分别占炎性细胞的百分比均明显地低于DMSO对照组，而10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组之间却没有明显差异。
　　 4.各组大鼠淋巴结MNC表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子的表达情况
　　 与DMSO对照组相比，10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组均明显的低表达CD80，但10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组之间CD80的表达没有明显差异。另外，CD86和MHC-Ⅱ分子的表达在三组之间没有明显差异。
　　 5.各组大鼠淋巴结MNC中Treg细胞的表达情况
　　 结果显示，与DMSO对照组相比，10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组均上调了CD4+细胞中CD25+Foxp3+细胞的数量。但是两个治疗组之间却没有明显差异。
　　 6.阿托伐他汀对细胞培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-17的影响
　　 与对照组相比，10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组细胞培养上清中IFN-γ的水平明显的降低了。IL-17的表达在三组之间没有明显差异。
　　 结论:
　　 1.阿托伐他汀可以诱导EAN的免疫耐受。
　　 2.阿托伐他汀诱导EAN免疫耐受的机制主要是通过抑制Th1/Th17的应答、抑制淋巴结MNC表面共刺激分子的表达及上调Treg细胞的功能来实现的。
　　 3.阿托伐他汀对EAN大鼠的保护作用是剂量依赖性的。
　　 意义:
　　 本研究通过给予EAN大鼠腹腔注射不同剂量的阿托伐他汀溶液，发现阿托伐他汀能够诱导EAN的免疫耐受，且这种作用主要是通过抑制Th1/Th17的应答、抑制淋巴结MNC表面共刺激分子的表达、上调Treg细胞的功能来实现的。而且阿托伐他汀对EAN大鼠的保护作用是剂量依赖性的。这也为临床上治疗人类GBS提供了一种新的治疗策略和思路。

目录

声明

论文Ⅰ 阿托伐他汀诱导实验性自身免疫性神经炎免疫耐受的机制研究

摘要

符号说明

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

论文Ⅱ 阿托伐他汀修饰的树突状细胞诱导实验性自身免疫性重症肌无力免疫耐受的机制研究

摘要

符号说明

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

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