瑞氏木霉纤维素酶基因cbh1启动子突变分析及psi因子合成酶基因的功能研究

摘要

瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是工业化的纤维素酶生产菌株，可以分泌高效降解纤维素的酶系，其中纤维二糖水解酶CBHⅠ是降解纤维素的重要酶组分。瑞氏木霉纤维素酶基因的诱导表达受到碳源、转录调控因子及很多与次级代谢有关因素的影响。
　　瑞氏木霉纤维素酶基因cbh1启动子上存在大量的5'-GG(A/T)3-3'序列，其中5个5'-GGC(A/T)3-3'序列能够与转录激活因子Xyr1的DNA结合结构域(Xyr1DBD)结合。本论文采用体外酵母单交杂方法与瑞氏木霉体内检测cbh1启动子的突变体活性相结合的手段，研究了这5个5'-GGC(A/T)3-3'序列中第二个鸟嘌呤核苷酸的突变对转录因子Xyr1与其结合能力的影响。同时，本文通过构建瑞氏木霉缺失突变体的手段，研究了参与多种次级代谢产物合成过程的psi因子合成酶Ppo对纤维素酶诱导表达的影响。
　　本论文取得的的主要研究结果如下:
　　1.酵母单杂交分析cbh1启动子点突变后活性变化，证明转录因子Xyr1可能与cbh1启动子中的4个5'-GGC(A/T)3-3'序列结合而影响cbh1的表达。
　　为了探讨Xyr1与cbh1启动子可能的结合位点及相互作用机制，对启动子中5个5'-GGC(A/T)3-3'序列（分别位于cbh1启动子上-187R、-320、-510R、-733R、-778位）中第二个鸟嘌呤核苷酸分别进行了点突变。采用酵母单杂交的技术手段，通过检测报告基因lacZ表达的β-半乳糖苷酶酶活水平来研究这些点突变对Xyr1的DNA结合结构域(Xyr1DBD)与启动子结合能力的影响。结果显示，突变位点为cbh1p-510R的突变株的β-半乳糖苷酶酶活与表达野生型cbh1启动子的菌株基本一致;突变位点分别为cbh1p-187R、cbh1p-320、cbh1p-733R、cbh1p-778的突变株的酶活则分别下降了23％、15％、26％和24％。据此推测，cbh1p-187R、cbh1p-320、cbh1p-733R和cbh1p-778四个位点处的5'-GGC(A/T)3-3'序列均有可能参与了Xyr1与cbh1启动子的结合。
　　2.在瑞氏木霉体内利用uidA作为报告基因分析cbh1启动子点突变对其活性的影响，证明5'-GGC(A/T)3-3'序列参与了Xyr1与cbh1启动子的结合。
　　通过构建表达载体，将上述cbh1启动子上5个六核苷酸序列5'-GGC(A/T)3-3'中第二个鸟嘌呤核苷酸分别突变的启动子序列分别表达在瑞氏木霉中，采用uidA作为报告基因，通过检测GUS酶活水平分析突变后的cbh1启动子活性，并与体外酵母单杂交实验得到的数据进行分析和比较。
　　结果显示，突变位点为cbh1p-510R的突变株酶活与野生型基本一致;突变位点分别为cbh1p-187R、cbh1p-320、cbh1p-733R、cbh1p-778的突变株酶活分别下降了50％、43％、45％和43％。推测点突变对cbh1启动子活性的影响主要是由转录因子Xyr1与启动子相互作用的变化引起，cbh1p-187R、cbh1p-320、cbh1p-733R、cbh1p-778位点处的六核苷酸序列参与了Xyr1与cbh1启动子的结合。
　　3.编码瑞氏木霉psi因子合成酶Ppo基因ppoa和ppob的缺失突变表明，ppo基因参与碳源底物代谢，影响菌体生长。
　　Psi因子合成酶Ppo参与了很多次级代谢产物的合成过程。为了研究psi因子合成酶在瑞氏木霉纤维素酶诱导合成中的作用，我们对两个编码psi因子合成酶的基因ppoa和ppob分别进行了基因敲除，构建ppoa和Δppob，并对缺失菌株的表型进行了研究。结果显示，ppo基因的缺失影响了菌株在以麦芽浸膏、乳糖、木糖、葡萄糖、羧甲基纤维素钠、纤维二糖、甘油、微晶纤维素、木聚糖分别为唯一碳源的固体平板上的生长，促进了菌株的衰老以及次级代谢产物如色素的产生。通过对缺失菌在微晶纤维素诱导条件下发酵液pNPC酶活的测定和对CBHⅠ信号的Western免疫印迹检测，发现ppo的缺失对瑞氏木霉纤维素酶的诱导表达并没有太大影响。