RNA干扰survivin和survivin小分子抑制剂YM155对食管鳞癌KYSE150细胞体内外放射敏感性的实验研究

摘要

背景： 食管癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，据报道，85％的食管癌患者存在于发展中国家。在中国，食管癌发病率尤其高，据世界卫生组织与我国公布的肿瘤调查统计资料，国内每年初发食管鳞癌患者高达25万人，几乎占全世界食管癌患者的一半。临床上食管癌首选治疗手段是手术，但是由于早期食管癌症状表现不明显，大多数患者确诊时由于肿瘤原发灶较大，常伴有局部浸润或淋巴结转移，错过了最佳手术时机或无法行根治性手术切除，需要进行放射治疗。食管癌单纯放疗的5年生存率是10-15％。肿瘤细胞对射线抗拒，导致病灶局部未控或复发是放疗失败的一个主要原因。寻找放疗敏感性的分子标志物，提高食管癌局部控制率是本研究的主要目的近年来，随着分子生物学的发展，关于分子标记物在肿瘤治疗方面的研究报道层出不穷，几种分子标记物已经应用到临床。众所周知，细胞凋亡是反应肿瘤生物学行为的一个关键指标，在肿瘤发生发展过程中起到重要作用。其中，IAP家族是一族重要的凋亡抑制因子。其家族成员结构类似，蛋白质分子的共同特征是均含有2个或3个串联的具有半胱氨酸/组氨酸残基的杆状病毒IAP重复区序列(BIR)，与此相邻的羧基末端含有一个环指结构，功能相近可直接抑制凋亡信号传导通路中的终末效应分子（如caspase-3和caspase-7）而发挥直接的凋亡抑制作用，在凋亡的负调控上有重要作用。Survivin基因也被称作Birc5或细胞凋亡抑制基因，在人体中是由Birc编码的凋亡抑制家族中的一员。其在细胞中的生理功能涉及到细胞有丝分裂的调控、细胞凋亡和肿瘤中血管的生成等，与肿瘤发生发展关系密切。与其它调控基因相比，survivin基因优势在于，其选择性的在肿瘤组织中表达，在人类众多恶性肿瘤中几乎都表达，而在成人终末分化组织低表达或不表达，其独特的结构和性质成为瞩目的焦点。而正是由于组织分布的相对特异，Survivin已经成为肿瘤靶向治疗的重要靶点。研究结果显示survivin是许多肿瘤，包括乳腺癌，肺痛结肠癌等临床预后的不利因素研究报道survivin高表达与食管癌预后较差相关，但关于survivin-siRNA和survivin小分子抑制剂YM155与食管癌放射敏感性的报道甚少。本研究通过分析87例术前放疗食管癌患者放疗前癌组织及术后组织中survivin的表达情况，探讨survivin表达与食管鳞癌放疗敏感性及与预后的相关性;通过构建Survivin特异性小干扰RNA(SiRNA)表达载体，转染人食管癌KYSE150细胞和survivin小分子抑制剂YM155处理KYSE150细胞，再联合X射线照射，观察survivin基因对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期和放射敏感性的影响，并初步探讨抑制survivin基因表达的放射增敏机制;通过观察荷瘤鼠经射线照射后瘤体体积变化，从体内水平评价survivin表达对放射线的增敏作用，为基因治疗联合放射治疗的临床应用提供理论基础和实验依据。 目的： 1.应用免疫组织化学法方法检测survivin在可手术的局部晚期食管鳞状细胞癌(ESCC)患者放化疗前胃镜标本及术后标本中的表达水平，探讨survivin表达与食管鳞癌放疗敏感性及与预后的相关性。 2.构建Survivin特异性小干扰RNA(SiRNA)表达载体，转染食管鳞状细胞癌KYSE150细胞，使其稳定表达，为研究survivin表达调控作用提供良好的细胞模型。 3.探讨survivin-siRNA和survivin小分子抑制剂YM155对食管癌KYSE150细胞生物学行为的影响，研究其对KYSE150体外放射敏感性的影响。 4.构建食管癌KYSE150细胞裸鼠移植瘤模型，探讨survivin-siRNA和survivin小分子抑制剂YM155体内对细胞增殖的影响。 方法： 1.免疫组织化学MaxVision法检测87例术前放疗食管癌患者放疗前癌组织及术后组织中survivin的表达情况，用统计学软件SPSS17.0对实验数据进行处理，分析survivin表达与食管癌患者临床病理参数之间的关系及其与预后的相关性。 2.构建包装survivin-shRNA慢病毒载体(GV118-survivin shRNA)和阴性对照载体(GV118-NC shRNA);在293T细胞中进行病毒包装和滴度测定;慢病毒载体感染食管癌细胞KYSE150细胞，筛选并获得稳定转染细胞株;RT-PCR及Western blot验证慢病毒载体的有效性。 3.根据处理时间和浓度的不同，用RT-PCR和Westernblot筛选出survivin小分子抑制剂(YM155)处理KYSE150细胞最佳有效组。 4.CCK-8实验和平板克隆形成实验检测转染组和YM155处理组联合射线(0Gy，2Gy，4Gy，6Gy，8Gy,10Gy)照射KYSE150细胞，对细胞增殖能力和存活分数的影响。 5.采用流式细胞术观察转染组和YM155处理组联合射线照射KYSE150细胞对细胞周期的影响。利用AnnexinⅤ-PE/7-MD双染色法检测细胞的凋亡情况。 6.建立稳定转染的KYSE150细胞株裸鼠移植瘤模型，观察荷瘤鼠经10Gy射线照射后瘤体体积的变化，从体内进一步探讨survivin表达抑制对食管癌组织放射敏感性的影响。 统计学方法 采用统计学软件SPSS17.0对实验数据进行处理，survivin蛋白的表达与食管癌临床参数及组织放疗后病理反应的相关性比较采用x2检验或校正后的x2检验，采用Kaplan-Meier方法计算生存率并应用Log-rank检验对食管癌患者行单因素预后分析。采用Cox风险模型进行多因素预后分析。均数±标准差((x)±s)表示各组数据，单因素方差(One-wayANOVA)分析比较均数，若差异有统计学意义进一步用LSD-t检验进行多组间的比较。每个实验均重复3遍，样本数是3。检验水准取α=0.05，P＜0.05认为差异有统计学意义。 结果： 1.survivin在食管癌组织放疗前后的阳性表达率分别是64.37％(56/87)和29.89％(26/87)，其在放疗前组织中的表达明显高于在治疗后组织中的表达，且差异有统计学意义（P=0.00）。survivin蛋白在食管鳞癌组织放疗前的表达与患者的年龄、性别、肿瘤位置、分化程度、病变长度和临床分期反应无明显相关性（P值分别为:0.59，0.76，0.99，0.96，0.95，0.67），在放疗后组织中的表达与各临床因素无明显相关性（P值分别为:0.55，0.82，0.79，0.99，0.96，0.12）。多因素分析结果显示影响食管癌患者总生存率的因素有放疗后survivin蛋白的表达(x2=5.38，P=0.02）与放疗后食管癌组织的病理反应（x2=0.62，P=0.04）。 2.成功构建了survivin-siRNA表达载体，经测序鉴定正确，RT-PCR结果显示pGV118-survivin-shRNA1转染KYSE150细胞48h时，survivin mRNA表达抑制率最为明显。 3.survivin小分子抑制剂YM155抑制survivin的表达呈时间和剂量依赖性，当100nm/LYM155作用KYSE150细胞48h时，survivin蛋白抑制率为(88.0±2.0)％。 4.X射线照射各组细胞后，流式细胞术AnnexinⅤ-PE/7-AAD双染色法检测survivin shRNA转染组和YM155处理组G2/M期细胞所占比例阴性对照及空白对照组明显降低，细胞凋亡率较阴性对照及空白对照组均明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 5.裸鼠移植瘤实验证实接种3周后抑制survivin表达组的平均瘤体体积较对照组明显减低，放射治疗10Gy后，抑制survivin表达组平均肿瘤体积明显减小(P＜0.05)，且survivin shRNA转染组和YM155处理组中survivin蛋白的表达呈弱阳性，而单纯X射线照射组survivin蛋白表达呈强阳性。 结论： 1、食管鳞癌组织中survivin蛋白呈阳性表达，survivin蛋白在食管鳞癌组织中放疗前后表达的变化及放疗后食管鳞癌的组织病理反应与患者预后密切相关，二者可能为食管鳞癌独立的预后因素，survivin可以作为筛选局部晚期食管癌患者是否行术前放疗的一个生物学指标。 2、RNA干扰survivin和survivin小分子抑制剂YM155对KYSE150细胞有放射增敏作用，其增敏机制与survivin基因表达抑制后，促进肿瘤细胞凋亡，缩短肿瘤细胞G2/M期阻滞和上调caspase3蛋白表达有关。 3、荷瘤鼠体内实验表明，survivin基因表达抑制后能够显著抑制荷瘤鼠体内食管癌生长，RNA干扰和YM155能协同提高食管癌病灶对X射线敏感性。 本研究提示，survivin在食管癌的发生发展中可能扮演癌基因的角色，并在调控食管癌细胞的增殖和凋亡等恶性生物学特性中发挥重要作用，RNA干扰技术和survivin小分子抑制剂YM155可以提高食管癌放疗敏感性。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 Survivin基因在食管癌放疗前后中的表达及与临床预后的关系

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

附图

第二部分：构建针对survivin基因的siRNA载体及稳定转染食管癌细胞株的建立

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第三部分 RNA干扰survivin基因和survivin小分子抑制剂YM155对食管鳞状细胞癌KYSE150体外放射敏感性的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附表和附图

第四部分 RNA干扰survivin基因和survivin小分子抑制剂YM155体内对KYSE150细胞放疗敏感性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附表和附图

结论

致谢

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