小麦胚乳发育中高分子量谷蛋白亚基基因启动子甲基化状态变化及其对相应基因表达的影响研究

摘要

小麦是世界上分布范围最广、种植面积和产量位居前三、加工制品最为丰富的粮食作物，其面粉加工品质主要由面粉中的麦谷蛋白和醇溶蛋白决定。已有的研究表明，谷蛋白的表达调控主要在转录水平上，但一些数据表明表观遗传修饰也发挥重要作用。本论文以中国春小麦为研究材料，首先利用5-azaC（甲基化抑制剂）对即将开花的小麦进行处理，通过与对照组比较，发现籽粒谷蛋白的积累水平提高了约21％;接着分析了小麦胚乳中10 DPA(days post-anthesis)、15DPA、20 DPA、25 DPA和30 DPA高分子量麦谷蛋白亚基(high-molecular-weightgluten subunit，HMW-GS)Bx7、By8和Dx2启动子区域（主要顺式作用元件区）甲基化状态。结果表明，与旗叶相比籽粒胚乳的各时期HMW-GS基因启动子区域甲基化水平明显降低。不同发育时期胚乳的甲基化程度，10 DPA的甲基化状态最高，5-azaC处理后甲基化降低最明显（如Bx7-561～-90区段、By8-789～-364区段）。但对甲基化程度本身很低的区段（如Bx7-849～-503区段、By8-445～-5区段、Dx2-789～-462区段），5-azaC处理对甲基化程度影响不明显;为了进一步研究甲基化变化对HMW-GS基因表达的影响，我们对经5-azaC处理的幼穗进行HMW-GS基因表达分析，结果发现50μM5-azaC处理组甲基化程度整体呈降低趋势，且基因表达也整体上调，尤其对甲基化程度降低比较明显的亚基(如Bx7、By8)基因表达上调的更明显，这说明HMW-GS基因启动子甲基化水平的降低与相应基因表达具有相关性;同时我们进行了麦谷蛋白基因三个主要调控转录因子TaSPA、TaPBF和TaGAMYB的实时定量分析，结果发现，在5-azaC处理下，各转录因子表达虽然在10 DPA时受抑制，但是15 DPA、20 DPA、25 DPA与HMW-GS各亚基表达趋势相一致，利用相关性软件分析发现转录因子的表达与各亚基的表达之间呈显著正相关，其中，转录因子TaPBF-B、TaPBF-D与By8、Dx2、Dy12亚基之间的相关性极显著，结果表明了转录因子对HMW-GS表达调控的重要作用。为了进一步研究转录因子的表达对于甲基化的影响，我们构建了三个转录因子TaSPA、TaPBF、TaGAMYB的真核表达载体并转化小麦，目前成功获得了1株转TaSPA-B基因的T1代阳性小麦，3株转TaPBF-DT0代阳性小麦。此外，我们还构建了三个转录因子原核表达载体，纯化了TaSPA及TaPBF蛋白，为下一步抗体制备并研究转录因子与相关不同甲基化顺式作用元件的结合规律奠定基础。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 小麦高分子量谷蛋白亚基基因的表达调控

1．2 禾谷类SSPs基因转录水平的表达调控

1．2．1 SSPs基因表达相关转录因子的研究进展

1．2．2 转录因子之间相互作用及可能的调控机制

1．3 DNA的甲基化及甲基化酶的研究概述

1．3．1 表观遗传与DNA的甲基化

1．3．2 DNA的甲基化方式及甲基化酶

1．3．3 DNA的甲基化对基因的表达调控

1．3．4 甲基化酶抑制剂及其可能的作用机制

1．4 DNA的甲基化、转录因子与基因表达之间的关系模型

1．4．1 转录因子结合到非甲基化区域从而使其免除甲基化

1．4．2 转录因子招募相关因子促进相关DNA甲基化

1．4．3 转录因子结合到甲基化的DNA上去除甲基化

1．5 SSPs表达调控的其他机制

1．6 本研究的目的、主要研究内容和意义

1．7 技术路线

第二章 HMW-GS启动子区域甲基化状态及相关基因表达分析

2．1 实验材料及试剂

2．1．1 植物材料

2．1．2 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 植物材料种植与处理

2．2．2 幼穗的采集

2．2．3 谷蛋白的提取

2．2．4 谷蛋白含量的测定

2．2．5 DNA的提取

2．2．6 重亚硫酸盐转化DNA

2．2．7 重亚硫酸盐测序引物设计

2．2．8 重亚硫酸盐测序片段扩展及测序

2．2．9 小麦胚乳RNA的提取

2．2．10 RNA的反转录

2．2．11 实时定量PCR检测各HMW-GS及相关转录因子表达量

2．2．12 相关性分析

2．3 实验结果

2．3．1 50、100 μM 5-azaC抑制剂处理组HMW-GS蛋白表达量分析

2．3．2 50、100 μM 5-azaC处理组HMW-GS mRNA水平表达情况分析

2．3．3 对照组、50 μM 5-azaC处理组核心启动子区域甲基化程度分析

2．3．4 胚乳不同发育时期甲基化程度与HMW-GS亚基表达分析

2．3．5 对照组、50 μM-azaC处理组基因表达调控相关转录因子表达量及相关性分析

2．4 讨论

第三章 胚乳发育相关转录因子真核表达载体的构建及转化小麦

3．1 材料与试剂

3．1．1 植物材料

3．1．2 基因序列

3．1．3 实验试剂

3．2 实验方法

3．2．1 TaSPA B、TaPBF D、TaGAMYB D目的片段的扩增

3．2．2 TaSPA B、TaPBF D、TaGAMYB D目标片段的回收及阳性菌落筛选

3．2．3 质粒的提取及真核表达载体的构建

3．2．4 农杆菌感受态的制备及转化

3．2．5 农杆菌介导的小麦苗端生长点转化

3．3 实验结果

3．3．1 TaSPA、TaPBF、TaGAMYB的扩增

3．3．2 TaSPA、TaPBF、TaGAMYB酶切及载体酶切

3．3．3 农杆菌阳性菌落的鉴定

3．3．4 小麦遗传转化与转基因株系鉴定

3．3．5 实时定量PCR检测外源基因表达水平

3．4 讨论

第四章 胚乳发育相关转录因子原核表达载体的构建及蛋白纯化

4．1 实验材料

4．1．1 基因序列

4．1．2 实验试剂

4．2 实验方法

4．2．1 原核表达载体的构建

4．2．2 蛋白的诱导表达

4．2．3 SDS-PAGE检测基因的表达量

4．2．4 蛋白的纯化

4．3 实验结果

4．3．1 原核表达载体的构建

4．3．2 转录因子TaSPA-B、TaPBF-D、TaGAMYB-D蛋白的诱导

4．3．3 转录因子TaSPA-B、TaPBF-D蛋白的纯化

4．4 讨论

参考文献

致谢

硕士期间发表的文章

硕士期间参加的会议