MicroRNA-7a在急性心肌梗死诱导的心肌细胞损伤中的功能调控机制与作用研究

摘要

本研究分四部分进行论述:
　　第一部分:心肌梗死损伤对小鼠心肌细胞中Cdrlas和miR-7a表达水平的影响
　　目的：
　　1.明确小鼠梗死心肌组织中Cdrlas的表达水平是否发生变化;
　　2.确定小鼠梗死心肌组织中Cdrlas与miR-7a的表达变化是否一致;
　　3.探究缺氧培养条件下，小鼠心肌细胞中Cdrlas和miR-7a的表达变化是否一致。
　　方法：
　　1.MI小鼠模型建立
　　用0.8％戊巴比妥钠麻醉小鼠，仰卧固定后，口腔放置气管插管，沿胸骨左缘第四肋间隙剪开皮肤，行开胸手术。小心剪开心包后，永久性结扎冠状动脉左前降支(LAD)，构建MI小鼠模型。其中，假手术（sham）组小鼠同样于LAD下穿线，但不结扎血管。
　　2.MI模型评价
　　术后24 h，检测小鼠心室的心肌梗死面积、缺血危险区比例，以及血清LDH含量。
　　3.细胞培养
　　将分离提取的小鼠原代心肌细胞和MCM心肌细胞分别接种至含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、含5％ CO2的恒温培养箱中培养。
　　4.缺氧处理与分组
　　常规培养心肌细胞至对数生长期后，接种至新鲜DMEM完全培养基中，分别置于含氧量为20％（对照）和0％的37℃恒温培养箱中培养。
　　5.Real-time PCR检测Cdrlas的表达
　　用Trizol试剂提取心肌组织和细胞中的总RNA后，逆转录合成cDNA。使用Cdrlas和β-actin特异性引物，进行实时定量PCR反应。以β-actin为内参基因，计算Cdrlas的表达水平。
　　6.Real-time PCR检测miR-7a的表达
　　用TRIzol试剂提取心肌组织和细胞中的总RNA后，进行miR-7a特异性反转录。
　　结果：
　　1.MI模型评价
　　与未出现心肌梗死的sham组小鼠相比，MI组小鼠左心室中的心肌梗死面积和缺血危险区比例分别为60.0％和57.3％，提示小鼠MI建模成功。而且，相较于sham组小鼠，MI组小鼠血清的LDH含量增加了约2.4倍。
　　2.MI促进Cdrlas和miR-7a的表达上调
　　与sham组相比，MI术后6、12、24 h的小鼠心肌组织中的Cdrlas和miR-7a表达水平均显著上调，并表现出一定的时间依赖性。选用MI术后24 h作为后续实验观察点。
　　3.缺氧诱导心肌细胞中Cdrlas和miR-7a的表达增加
　　与正常培养的心肌细胞相比，缺氧培养3、6、12h后，小鼠心肌细胞中的Cdrlas和miR-7a表达水平均显著增加，并同样表现出时间依赖性。选用缺氧培养12h作为后续实验条件。
　　结论：
　　1.小鼠梗死心肌组织中Cdrlas的表达水平上调，且与miR-7a表达变化一致;
　　2.缺氧处理可以诱导小鼠心肌细胞中Cdrlas和miR-7a的共同高表达。
　　第二部分:MiR-7a通过调控PARP和SP1的表达影响缺氧导致的心肌细胞凋亡
　　目的：
　　1.明确miR-7a是否靶向调控SP1的表达;
　　2.探究PARP和SP1在miR-7a过表达减少缺氧导致的心肌细胞凋亡中的作用机制。
　　方法：
　　1.细胞培养
　　2.Real-time PCR检测PARP和SP1 mRNA的表达水平
　　3.Western blot检测PARP和SP1的蛋白表达水平
　　4.双荧光素酶报告基因检测
　　5.Caspase-3活性检测
　　6.细胞凋亡检测
　　缺氧处理各组MCM心肌细胞12h后，使用FITC AnnexinⅤ细胞凋亡检测试剂盒，检测各组MCM细胞的细胞凋亡比例。
　　结果：
　　1.miR-7a对PARP和SP13'UTR的靶向抑制
　　miR-7a过表达可以显著降低PARP和SP1野生型报告基因组中的荧光素酶相对活性，相应突变型报告基因载体组中的荧光素酶相对活性则无明显变化。
　　2.miR-7a靶向调控PARP和SP1的表达
　　miR-7a过表达可以显著降低PARP、SP1的mRNA和蛋白表达水平。以上结果表明，PARP和SP1均为miR-7a的靶基因。
　　3.miR-7a通过抑制PARP和SP1表达，减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡
　　miR-7a过表达可以显著降低缺氧诱导的caspase-3活性升高和细胞凋亡率增加。而进一步过表达PARP和SP1可以逆转miR-7a对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用。
　　结论：
　　1.miR-7a可以靶向调控小鼠心肌细胞中PARP和SP1的表达;
　　2.miR-7a通过抑制PARP和SP1的表达，减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡。
　　第三部分:Cdrlas通过抑制miR-7a的靶向调控功能促进小鼠心肌梗死
　　目的：
　　1.明确Cdrlas过表达对心肌细胞凋亡的影响;
　　2.探究Cdrlas是否通过影响miR-7a靶基因PARP和SP1的表达，参与心肌细胞凋亡调控;
　　3.验证miR-7a在Cdrlas促进小鼠心肌梗死中的作用机制。
　　方法：
　　1.细胞培养
　　2.细胞转染与分组
　　3.Real-time PCR检测PARP和SP1 mRNA的表达水平
　　4.Western blot检测PARP和SP1的蛋白表达水平
　　5.Caspase-3活性检测
　　6.细胞凋亡检测
　　结果：
　　1.Cdrlas过表达对miR-7a及其靶基因表达水平的影响
　　转染pcDNA-Cdrlas后，Cdrlas的表达水平上调了约2.3倍，表明Cdrlas过表达细胞株构建成功。而且，Cdrlas过表达细胞株中，miR-7a的表达水平无明显变化，miR-7a靶基因PARP和SP1的表达水平则均显著增加。
　　2.miR-7a过表达对Cdrlas诱导的心肌细胞凋亡的影响
　　Cdrlas过表达可以显著增加MCM心肌细胞的caspase-3活性和细胞凋亡率，诱导心肌细胞凋亡。进一步过表达miR-7a，可以显著降低Cdrlas诱导的心肌细胞凋亡，提示Cdrlas可能通过抑制miR-7a活性，促进心肌细胞凋亡。
　　3.Cdrlas通过抑制miR-7a的靶向调控功能，促进小鼠心肌梗死
　　体内转染pcDNA-Cdrlas后，MI小鼠的心肌梗死面积、缺血危险区比例和血清LDH含量均显著增加，并伴随PARP和SP1的表达上调。
　　结论：
　　1.miR-7a过表达抑制Cdrlas诱导的心肌细胞凋亡;
　　2.Cdrlas可以通过抑制miR-7a功能，上调靶基因PARP和SP1的表达，进而促进小鼠心肌梗死。
　　第四部分:姜黄素通过调控miR-7a表达保护小鼠心肌细胞避免心肌梗死损伤
　　目的：
　　1.确定姜黄素对MI小鼠的心肌保护作用;
　　2.研究姜黄素对MI小鼠心肌细胞中miR-7a和SP1表达水平的影响;
　　3.探究miR-7a在姜黄素保护心肌细胞避免MI损伤中的作用机制。
　　方法：
　　1.姜黄素给药与MI小鼠模型建立
　　2.细胞培养
　　3.细胞转染与分组
　　4.Real-time PCR检测miR-7a的表达水平
　　5.Real-time PCR检测SP1 mRNA的表达水平
　　6.Western blot检测SP1的蛋白表达水平
　　7.Caspase-3活性检测
　　8.细胞凋亡检测
　　结果：
　　1.姜黄素对心梗后心肌损伤和miR-7、SP1表达水平的影响
　　姜黄素给药可以显著降低MI小鼠的心肌梗死面积、缺血危险区比例和血清LDH含量，减弱MI引发的心肌细胞损伤。
　　2.姜黄素对缺氧诱导的MCM细胞凋亡的影响
　　姜黄素预处理可以显著降低缺氧诱导的caspase-3活性升高和凋亡细胞比例增加，减少缺氧诱导的MCM细胞凋亡。
　　3.miR-7a或SP1对姜黄素抑制缺氧诱导的细胞凋亡的影响
　　姜黄素对缺氧诱导的caspase-3活性升高和凋亡细胞比例增加的抑制作用，均可被miR-7a干扰或SP1过表达逆转。
　　4.miR-7a干扰可以取消姜黄素对缺氧诱导的SP1表达增加的抑制作用
　　姜黄素对缺氧诱导的SP1表达增加的抑制作用，也可被miR-7a干扰逆转，提示miR-7a通过调控SP1的表达参与姜黄素的心肌保护作用调控。
　　结论：
　　1.miR-7a可以调控缺氧诱导的SP1表达变化
　　2.姜黄素通过抑制缺氧诱导的miR-7a表达降低，进一步抑制SP1的表达增加，从而保护心肌细胞避免心梗后的心肌损伤和缺氧诱导的细胞凋亡。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：心肌梗死损伤对小鼠心肌细胞中Cdr1as和miR-7a表达水平的影响

1 前言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 结论

附图

参考文献

第二部分：MiR-7a通过调控PARP和SP1的表达影响缺氧导致的心肌细胞凋亡

1 前言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 结论

附图

参考文献

第三部分：Cdr1as通过抑制miR-7a的靶向调控功能促进小鼠心肌梗死

1 前言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 结论

附图

参考文献

第四部分：姜黄素通过调控miR-7a表达保护小鼠心肌细胞避免心肌梗死损伤

1 前言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 结论

附图

参考文献

综述 MicroRNA-7在肿瘤和心脏疾病中的重要作用

致谢

攻读学位期间发表的论文